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前言中性粒细胞是外周血循环和免疫系统中最丰富的白细胞,它具有很短的半衰期,很快经历自发性凋亡以利于正常细胞的周转和免疫系统的稳态。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)是造血系统中重要的炎性细胞因子,它们能够促进造血干细胞的增殖、分化,并能促进中性粒细胞的成熟。它们均能够通过延迟细胞凋亡而促进中性粒细胞的存活、从而增强中性粒细胞的功能。已有研究表明上述炎性细胞因子的抗中性粒细胞凋亡作用与Bcl-2蛋白家族成员,如Mcl-1,Al,和Bax等,以及凋亡蛋白抑制剂(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族成员,如cIAP-2的表达调控有关。然而具体的机制仍不十分清楚。Survivin是一种新近发现的结构独特的IAPs成员。到目前为止,研究发现人类survivin存在5种不同的剪接异构体。它们似乎具有独特的亚细胞定位和不同的凋亡调节功能。大量的研究显示,survivin在绝大多数人类肿瘤细胞中异常高表达,而且与病人不良的预后和复发密切相关,已有的针对survivin的反义核酸、RNA干扰、负显性突变等研究取得了一定的抗肿瘤治疗效果。然而越来越多的研究发现,survivin在正常成人细胞中也有表达,可能参与正常细胞的增殖与存活。最近发现,survivin在从囊性纤维化病人分离得到的终末分化的中性粒细胞中有较高的表达。此研究还发现,survivin在正常中性粒细胞中的表达能够被GM-CSF和G-CSF所诱导,并且应用反义寡核苷酸打靶中性粒细胞的survivin,能够取消细胞因子的抗凋亡作用。这些结果表明,survivin在中性粒细胞中可能以未知的机制参与细胞因子的细胞保护作用。本试验欲研究凋亡蛋白抑制剂家族成员survivin在GM-CSF/G-CSF诱导的抗中性粒细胞凋亡中所发挥的作用及相关的机制,从而为人们进一步研究中性粒细胞凋亡的调控提供新的实验依据和理论参考。方法在本实验中,我们分别应用了人类早幼粒白血病细胞株HL60以及新鲜分离的正常人外周血中性粒细胞。对于HL60细胞,我们分别应用全反式维甲酸(ATRA)和佛波酯(PMA)进行中性粒细胞和单核细胞的分化诱导。根据需要给予诱导分化的HL60细胞以及正常的中性粒细胞一定浓度的GM-CSF或G-CSF处理。Survivin mRNA在不同细胞的表达水平,通过实时定量PCR SYBR Green法来检测;Survivin蛋白质的表达,应用多克隆兔抗人survivin抗体通过Western Blotting法来检测;此外,我们还应用Annexin V-FITC/PI染色、流式细胞术分析中性粒细胞的凋亡情况。最后,我们应用双脱氧末端终止测序法对HL60细胞和正常人中性粒细胞表达的survivin异构体的序列进行了测定。结果随着ATRA和PMA的诱导分化,HL60细胞中survivin mRNA的表达水平明显降低。在诱导分化的第4天,survivin mRNA的水平均降低至不到原先水平的1%。相应地,原先高表达的survivin蛋白,在诱导分化第4天时变得检测不到。在ATRA诱导HL60细胞分化过程中,给予10 ng/mL的GM-CSF处理,survivin的表达水平与未处理组相比明显增加。对于已分化的中性粒细胞样HL60细胞,GM-CSF能重新诱导survivin的表达,并且此作用具有时间和剂量的依赖性,在1ng/mL的GM-CSF处理24小时的时间点上,获得最高的survivin表达。与此不同的是GM-CSF未能增加PMA诱导分化过程中HL60细胞survivin的表达。然而与HL60细胞不同,终末分化的正常人中性粒细胞,在无细胞因子培养24小时的条件下,survivin mRNA的水平自发性增加了6倍。而10 ng/mL,50 ng/mL的GM-CSF和25 ng/mL的G-CSF未能引起survivin mRNA水平的进一步增加。无细胞因子处理组与细胞因子处理组之间survivin mRNA的表达水平无显著性差异。虽然没能诱导survivin的表达,GM-CSF/G-CSF仍然发挥着抗中性粒细胞凋亡的作用。在培养了6小时和24小时的中性粒细胞中,GM-CSF/G-CSF能够分别减少凋亡细胞比例5%～10%和15%～20%。进一步对HL60细胞和中性粒细胞表达的survivin异构体序列的测定显示,HL60细胞表达野生型survivin,而中性粒细胞表达具有促凋亡潜能的survivin-2α异构体。结论在本研究中,我们发现survivin的表达随着HL60细胞的分化而减少。在ATRA诱导分化的中性粒细胞样HL60细胞中,survivin的表达能够被GM-CSF诱导增加。然而GM-CSF对单核细胞样分化的HL60细胞无诱导作用。GM-CSF/G-CSF不能诱导正常终末分化的中性粒细胞表达survivin。HL60细胞与中性粒细胞所表达的survivin剪接异构体不同,这可能是他们对于GM-CSF反应不同的基础。Survivin并不参与GM-CSF/G-CSF的抗中性粒细胞凋亡作用。