富马酸(Fumaric acid)，亦称延胡索酸，其作为一种重要的四碳平台化合物，广泛应用于医药、化工、树脂等领域。目前富马酸主要是由化学合成法生产，但随着资源的不断消耗以及化学法所引起的环境污染等问题，微生物发酵法因其原料可再生及环境污染小等优势越来越受到广泛关注。　　目前，生产富马酸的主要菌株是米根霉，但米根霉在发酵过程形态难以控制，严重制约了发酵法生产富马酸的产业优进程。而大肠杆菌作为模式微生物具有培养条件简单、遗传信息清晰且过程调控相对简单等特点，是马酸生产的理想菌株。但原始大肠杆菌虽然具有富马酸的代谢途径，却不积累富马酸，因此欲实现大肠杆菌对富马酸的积累，就有必要对现有菌株进行基因改造。本研究基于基因组代谢规模网络(GSMM)，模拟敲除相关基因，考察基因敲除对菌株生长及富马酸合成的影响，并以此为指导进行大肠杆菌的基因改造。本研究主要结果如下:　　(1)基于基因组代谢规模网络模拟确定大肠杆菌基因改造策略　　基于iJ01366模型，借助于Matlab平台，对其碳中心代谢的33个反应分别在厌氧条件下进行敲除模拟，最终发现涉及参与三个反应的关键基因（FumA、FumB、frd)的敲除及poxB、pflB和ackA基因的抑制可实现富马酸的积累。　　(2)大肠杆菌厌氧发酵生产富马酸的途径改造　　根据模拟结果，采用同源重组技术敲除FumA、FumB及frd基因构建MXQ3敲除菌株，对MXQ3进行发酵实验，发现其能积累少量富马酸(0.369 g/L)，较原始菌株提高了120.71％。在此基础上，利用小RNA(sRNAs)干扰技术分别干扰副产物基因（poxB、pflB、ackA）的表达，以减少副产物合成途径的碳流，并根据单基因干扰下的产量变化，对以上基因采用sRNAs干扰进行两两组合抑制，从而获得同时抑制基因poxB和pflB表达的重组厌氧菌株MXQ5和同时抑制基因poxB和ackA表达的重组厌氧菌株MXQ6。菌株MXQ5最终富马酸产量达0.881 g/L，而MXQ6菌株的富马酸产量达0.634 g/L，较对照组(MXQ3)分别提高了138.75％和71.82％，菌株MXQ5和MXQ6的发酵实验表明通过该策略能够有效提高富马酸产量。　　(3)大肠杆菌耗氧发酵富马酸的途径改造　　通过比较米根霉中富马酸的代谢途径以及大肠杆菌的相关代谢特征，确定耗氧培养条件下大肠杆菌的基因改造策略:采用基因敲除技术敲除frd、ldhA、adhE基因，获得改造菌株MXQ2，并采用sRNA干扰技术干扰mgsA、pta基因的表达，获得最终改造菌株MXQ4，富马酸摇瓶发酵产量由原始菌株的0.014 g/L提高至1.098 g/L，较MXQ2菌株(0.449 g/L)的富马酸产量提高了144.54％。