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目的:随着我国经济的发展,人们生活方式的改变及老龄化进程的加速,我国糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者的发病率正呈上升的趋势,严重影响了人们的生活质量。糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是DM微血管并发症之一,长期慢性高血糖是其发病基础,代谢、内分泌及血液因素促其发生、发展。DR的发病机制主要有多元醇通路、蛋白激酶C活化、糖基化终产物形成及其受体活化、氨基己糖途径和氧化应激水平升高等,其中氧化应激水平升高是DR发病的早期事件及始动环节。因此,研究氧化应激损伤在DR发病中的作用及分子机制对DR的早期防治具有重要意义。Micro RNAs(mi RNAs)是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码小RNA,通过抑制m RNA的转录后翻译调控蛋白的表达。众多研究发现,氧化应激病理状态下mi RNAs表达谱改变并通过其作用靶点发挥重要的作用。但在氧化应激致DR发病早期,mi RNAs表达的改变及其对靶分子的调控机制尚不明了。自由基生成与降解不平衡会导致活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平升高,从而增高氧化应激水平,H2O2是体内ROS的一种,并且血管内皮细胞损伤是DR发病机制的一个重要特征。因此,我们的研究通过给予原代培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)H2O2刺激制备氧化应激细胞模型模拟DR早期病变,通过基因芯片技术检测mi RNAs表达谱的改变。挑选出差异性表达mi RNAs对其进行Real-time PCR验证,通过在线软件预测其靶分子,并进行生物信息学分析,从而筛选出可能与氧化应激致DR发生有关的mi RNAs,不仅可以在基因水平上进一步揭示在DR发病的机制,同时为DR的治疗提供了全新的角度。方法:原代HUVECs分离培养:采用胶原酶灌注消化法分离HUVECs,接种至包被有多聚赖氨酸的25cm2的培养瓶中,24h后更换培养液,以后根据细胞生长情况更换培养液。当原代细胞融合90%以上后,加入0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化,传代培养。第四代内皮细胞用于测定细胞活力及凋亡、坏死,并且收集细胞提取RNA进行基因芯片筛选及Real-time PCR验证。原代HUVECs的鉴定:应用兔抗人Ⅷ因子单克隆抗体对第一代HUVECs进行免疫细胞化学染色,鉴定原代HUVECs。CCK-8法测定细胞活力:显微镜下观察,将第四代HUVECs随机分为5组,每组中分别加入0μM、100μM、200μM、400μM、500μM、600μM、800μM的H2O2,继续培养8、16、24小时,用CCK-8法测定细胞活力,观察细胞损伤情况,选择合适的H2O2刺激浓度及刺激时间。Annexin V-FITC/PI荧光染色检测HUVECs凋亡及坏死率:将长至约70%的第四代HUVECs随机分为2组,其中一组加入正常培养液,另一组加入含200μM H2O2的培养液,24 h后用Annexin V-FITC/PI荧光染色,流式细胞仪检测HUVECs凋亡率及坏死率。提取细胞总RNA送至杭州联川生物科技有限公司进行mi RNAs基因芯片检测:提取正常培养和200μM H2O2刺激24 h后的HUVECs总RNA送至杭州联川生物科技有限公司检测HUVECs mi RNAs的表达谱。mi RNAs生物信息学分析:根据mi RNAs芯片结果、文献中氧化应激状态下mi RNAs表达的改变和在mi RNAs在内皮细胞中的表达量筛选出25个可能与我们的研究相关的mi RNAs,应用DAVID软件对mi RNAs的靶基因进行生物信息学分析。筛选与DR发病有关的mi RNAs采用Real-time PCR方法进行验证。统计学方法:所有数据采用x±s表示。用SPSS 13.3软件进行数据处理,采用方差分析和独立样本t检验进行统计学分析,以P<0.05为有统计学意义。结果:1 HUVECs鉴定:兔抗人Ⅷ因子单克隆抗体免疫细胞化学染色,阳性反应物呈棕黄色,反应物分布于内皮细胞的胞质内。显微镜下观察,第一代HUVECs胞体饱满,呈梭形或多边形,细胞表面光滑,边界清楚。2细胞活力测定:不同浓度的H2O2刺激HUVECs不同时间后,细胞活力明显降低(P<0.01),并且表现出一定的剂量和时间依赖性。3 Annexin V-FITC/PI荧光染色检测HUVECs凋亡及坏死:与正常培养的HUVECs比较,200μM H2O2刺激24 h后细胞凋亡与坏死明显增多(P<0.05)。4 mi RNAs芯片结果:与正常对照组相比,H2O2刺激组有40个差异表达的mi RNAs(P<0.05),综合考虑mi RNAs芯片结果、文献中氧化应激状态下mi RNAs表达的改变、mi RNAs在内皮细胞中的表达量及生物信息学分析的结果,我们的实验选择mi R-638、mi R-1246、mi R-1275、mi R-4267、mi R-4324、mi R-4734、mi R-15b-5p进行Real-time PCR验证。5生物信息学分析结果显示:这些差异性表达的mi RNAs参与了细胞凋亡、蛋白的泛素化及磷酸化、2型糖尿病、钙离子通道的转运、血管平滑肌的收缩、神经营养因子转运、胰岛素信号通路、癌症抑制与生成等多个生物学过程,其中21个mi RNAs的33个靶基因(包括mi R-4267)参与了凋亡的信号通路过程。6差异性表达mi RNAs的验证:结果显示,mi R-638、mi R-1246、mi R-4267在HUVECs H2O2刺激组表达明显上调与芯片结果大致相同。7对mi R-4267进行GO分析,结果显示:mi R-4267的靶基因主要参与了细胞凋亡等多种生物学过程的调控。结论:1 H2O2刺激HUVECs导致细胞活力明显下降,细胞凋亡及坏死增加,说明氧化应激、细胞凋亡与DR有密切的关系。2基因芯片结果显示H2O2可引起HUVECs mi RNA表达谱的明显改变,提示氧化应激、mi RNAs参与DR的发病。3生物信息学分析结果揭示了氧化应激状态下mi RNAs可能参与凋亡信号通路,可能是DR发病机制之一。