背景肺癌在世界范围内严重威胁人类健康，尽管诊断手段，手术治疗技术，放疗和化疗方法不断更新发展，过去的30年里肺癌5年生存率仍然只有13-15％。研究发现肿瘤的形成是个复杂的分子调控失控过程，抑癌基因功能缺失及致癌基因的活化、过表达是肺癌形成的关键。近年来随着人表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂等基因靶向药物的问世，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的治疗取得了长足的进步，也为攻克肿瘤带来了新的希望，所以寻找更多与肿瘤相关特异表达基因，并研究他们之间的调控关系，有助于阐明肿瘤的分子发病机制，开发新的分子靶向药物。本课题前期工作发现肿瘤抑制基因RNA结合蛋白5（RNA Binding MotifProtein5，RBM5，又称Luca15、H37）与肺癌关系密切。早期肺癌、乳腺癌及肾癌患者在3p21.3位置经常出现等位基因纯合子或杂合子缺失。这个区域共有19个基因，被统称为肿瘤抑制基因（TSGs），在不同程度上表现出相应的肿瘤抑制作用。RBM5就位于这19个基因的末端，目前研究认为：RBM5具有介导细胞凋亡，影响细胞周期，调控不同基因在转录过程中的选择性拼接等作用。关于RBM5在肺癌组织上的表达及其功能方面的研究，目前国内外罕见报道，且多数局限于细胞系的体外实验。表皮生长因子受体（EGFR，HER-1/ErbB1）是酪氨酸激酶受体家族成员之一。KRAS是RAS基因家族成员之一。目前研究表明EGFR及其信号转导途径的下游相关基因KRAS在肿瘤组织中存在过表达及基因突变，其在肿瘤形成、进展中起到至关重要的作用。HER2也是酪氨酸激酶受体家族受体成员之一，前期研究证实HER2过表达可以改变RBM5不同转录体的表达状态。组织激活RAS突变蛋白（RASG12V）在大鼠胚胎成纤维细胞中可下调RBM5表达。在EGFR活化的肺腺癌NCL-H975细胞中下调活化EGFR没有上调RBM5表达。根据上述结果，我们考虑RBM5的调控凋亡、抑制细胞增殖功能与EGFR信号转导途径有密切联系，RBM5是否作为EGFR途径的上游基因，通过调控EGFR信号途径中的基因表达来抑制肿瘤的发生?将来RBM5能否作为一个新肺癌治疗靶点协同或增强EGFR靶向药物肺癌治疗效果?本文初步研究在非小细胞肺癌中这三个基因之间的关系，并探讨它们在非小细胞肺癌分子发病机制和靶向治疗中的作用。目的通过体内、外实验探讨RBM5、EGFR及KRAS基因在NSCLC中的表达及三者相关性；观察过表达RBM5基因后EGFR、KRAS基因表达的变化及对肺癌细胞增殖的影响，明确RBM5-EGFR途径在非小细胞肺癌发病中作用的分子机制，为探寻肺癌治疗新靶点及分子靶向治疗奠定基础。研究方法：1.采用RT-PCR、Western blot法检测120例人NSCLC组织RBM5和EGFR、KRAS mRNA及蛋白的表达，统计分析RBM5和EGFR、KRAS表达的相关性及三个基因表达与临床特点的相关性（包括吸烟史、淋巴结转移、肺癌分期、病理分型、性别、年龄）。2.脂质体法瞬时转染pcDNA3.1-RBM5于A549细胞，获得RBM5高表达的A549细胞体外研究模型；PCRArray法筛查过表达RBM5后A549细胞中肿瘤药物靶向基因的mRNA变化；并对筛查出来的部分基因EGFR、KRAS，采用RT-PCR、Western blot法检测其在过表达RBM5后A549细胞中mRNA及蛋白表达。3.将未经处理的A549细胞接种于BALB/c裸鼠，获得移植瘤模型，再以减毒沙门氏菌为载体，携带pcDNA3.1-RBM5质粒经尾静脉注射治疗，观察RBM5对移植瘤生长的影响；RT-PCR、Western blot及免疫组化染色法检测移植瘤组织中治疗前后RBM5和EGFR、KRAS基因表达，统计分析三个基因在肺癌移植瘤中表达的相关性。结果1.人非小细胞肺癌（NSCLC）组织中RBM5、EGFR及KRAS基因的表达（1）RBM5mRNA和蛋白在NSCLC组织中的表达：肺癌组低于正常组(P＜0.05)，吸烟组低于非吸烟组(P=0.001)；淋巴结转移组低于非淋巴结转移组(P=0.007)；在肿瘤分期中，IIIA和IIIB期低于I和IIA期(P=0.029)；与组织分型、性别、年龄无关。在非小细胞肺癌中存在RBM5基因表达缺失，且其缺失与吸烟、淋巴结转移及肿瘤分期相关。（2）EGFR mRNA和蛋白在NSCLC组织中的表达：肺癌组高于正常组(P＜0.05)，淋巴结转移组高于非淋巴结转移组(P=0.009)；在肿瘤分期中，IIIA和IIIB期高于I和IIA期(P=0.031)；与吸烟、组织分型、性别、年龄无关。EGFR基因在非小细胞肺癌中过表达，其过表达与肺癌的淋巴结转移及肿瘤分期相关。（3）KRAS mRNA和蛋白在NSCLC组织中的表达：肺癌组高于正常组(P＜0.05)，淋巴结转移组高于非淋巴结转移组(P=0.01)；在肿瘤分期中，IIIA和IIIB期高于I和IIA期(P=0.022)；吸烟组高于非吸烟组（P=0.002)；与组织分型、性别、年龄无关。KRAS基因在非小细胞肺癌中过表达，其过表达与吸烟、肺癌的淋巴结转移及肿瘤分期相关。（4）在NSCLC组织中RBM5与EGFR、KRAS蛋白及mRNA表达呈负相关（(P<0.01)。提示RBM5基因在非小细胞肺癌中的高表达可影响或下调EGFR、KRAS基因过表达。2.在A549细胞中RBM5基因过表达后EGFR、KRAS基因的表达（1）转染pcDNA3.1-RBM5后的A549细胞与对照组的A549细胞相比，出现明显的生长抑制。RBM5过表达可抑制腺癌A549细胞的生长。（2）PCRArray筛查结果：被检测的91个肿瘤药物靶向基因中，有20个基因出现有意义的变化，其中PIK3CA、PIK3C3、PLK4、KRAS、EGFR等基因mRNA表达降低达3倍以上。RBM5过表达后可下调上述基因的mRNA表达。(3）RT-PCR、Western blot检测结果：转染pcDNA3.1-RBM5后，EGFR、KRAS基因mRNA及蛋白表达较转染前显著降低（P<0.05）。RBM5高表达可下调腺癌A549细胞中EGFR、KRAS基因的表达。3.在肺腺癌裸鼠移植瘤中RBM5基因过表达后EGFR、KRAS基因的表达（1）尾静脉注射高表达RBM5减毒沙门氏菌后，与对照组相比，肿瘤生长受到明显抑制（P<0.01）。尾静脉注射获得的高表达RBM5可抑制人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长。（2）RT-PCR、Western blot及免疫组化染色法结果：经pcDNA3.1-RBM5质粒治疗后，EGFR、KRAS mRNA及蛋白表达较治疗前显著下降（P<0.05）。在人肺腺癌裸鼠移植瘤组织中RBM5高表达可下调EGFR、KRAS基因的表达。结论1.在人非小细胞肺癌组织中肿瘤抑制基因RBM5表达降低，癌基因EGFR、KRAS表达增高，提示RBM5基因表达缺失与EGFR、KRAS基因过表达共同参与了非小细胞肺癌的发生。2. RBM5低表达及EGFR、KRAS高表达与肿瘤分期、淋巴结转移相关，且RBM5、KRAS表达与吸烟相关。提示RBM5基因表达缺失与EGFR、KRAS基因过表达参与了肺癌的发展及转移。吸烟可通过影响RBM5、KRAS正常表达增加非小细胞肺癌的发病风险。3.在人非小细胞肺癌组织中RBM5表达与EGFR、KRAS表达呈负相关，提示调控肿瘤抑制基因RBM5正常或超表达可影响EGFR、KRAS的过表达，进而可能成为抑制肺癌发生，或者早期筛查肺癌的标志物。4. RBM5可能作为EGFR途径的上游基因，可在体内外微环境中，通过增加RBM5表达下调EGFR、KRAS水平的途径，抑制肺癌组织、细胞增殖，为非小细胞肺癌基因靶向治疗提供了新靶点。