脓毒症是指因感染引起宿主反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍。心脏作为脓毒症损害的重要靶器官之一,已有五十余年临床和基础研究的历史,约46%的脓毒症患者可出现心功能障碍。在脓毒症诱发的心功能障碍患者中,死亡率高达70%-90%。目前,线粒体功能障碍被认为是脓毒症心功能障碍的发病机制之一。线粒体自噬是高度保守的自稳态过程,参与线粒体的质量控制。研究证实,钙离子增敏剂左西孟旦在伴有心肌功能障碍的脓毒症模型中部分恢复了心脏的收缩与舒张功能,是一种针对脓毒症患者心脏功能异常的策略性疗法。然而,没有明确的研究支持左西孟旦作为脓毒症所致心功能障碍患者的最佳药物选择。解偶联蛋白（uncoupling protein 2,UCP2）存在于线粒体内膜上,其过表达对脓毒症心功能障碍模型心肌线粒体功能及线粒体动力学具有保护作用。基于此,本研究通过对脓毒症患者血浆UCP2浓度、左心功能进行观察研究,明确其变化情况及与脓毒症心功能障碍的相关性。进一步应用内毒素腹腔注射制备脓毒症心功能障碍小鼠模型,模拟临床脓毒症心功能障碍患者,检测脓毒症心功能障碍小鼠血浆的UCP2浓度,并应用左西孟旦改善脓毒症心功能障碍小鼠的心功能,明确左西孟旦对脓毒症心功能障碍小鼠的心功能、血浆炎症反应及氧化应激、心肌线粒体的影响,从而进一步明确左西孟旦在脓毒症心功能障碍的作用机制,为临床脓毒症心功能障碍患者改善心功能药物的选择提供理论基础。第一部分线粒体解偶联蛋白2水平与脓毒症患者心功能障碍相关性的观察研究目的:探讨血浆解偶联蛋白2（Uncoupling protein 2,UCP2）水平与脓毒症患者心功能障碍的相关性分析。方法:本文为前瞻性研究,纳入2021年5月至2022年2月于保定市第一中心医院重症医学科住院的脓毒症患者,其中住院期间未发生脓毒症心功能障碍患者为脓毒症组,发生脓毒症心功能障碍患者为脓毒症心功能障碍组,以及心脏血管外科住院拟行大隐静脉曲张手术的成年患者作为对照组。记录入组患者的一般资料,包括年龄、性别、基础合并症、脓毒症主要感染部位;记录入院24小时内的UCP2水平、动脉血乳酸、血浆心肌酶肌酸激酶同工酶（Creatine kinase-myocardial isoenzyme,CK-MB）、肌钙蛋白（Cardiac troponin I,c Tn I）、氨基末端脑钠肽前体（N-terminal pro-B type natriuretic peptide,NT-pro BNP）、超声心动图结果、急性生理和慢性健康评分-Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluationⅡ,APACHEⅡ）评分以及序贯多器官功能障碍（sequential organ failure assessment,SOFA）评分,合并脓毒症心功能障碍6小时内血浆UCP2水平、心肌酶CK-MB,c Tn I,NT-pro BNP水平及超声心动图情况。通过行列卡方检验、单因素方差分析或非参数检验比较对照组、脓毒症组及脓毒症心功能障碍组组间一般资料、心功能指标及UCP2水平的差异。通过相关性分析筛选出UCP2的相关因素。通过二元Logistic回归筛选出脓毒症心功能障碍发生的独立危险因素。结果:共入组159例患者,其中,对照（Control）组49例,脓毒症（Sepsis）组69例,脓毒症心功能障碍（Sepsis-induced myocardial dysfunctional）组41例。与对照组相比,脓毒症组及脓毒症心功能障碍组患者均存在感染因素,且心率较快,平均动脉压偏低,氧合指数偏低,APACHEⅡ及SOFA评分较高,同时,血乳酸、白细胞计数、降钙素原、红细胞压积、CK-MB、c Tn I、NT-pro BNP水平明显升高,住院时间、ICU停留时间及28天病死率明显升高;与对照组相比,脓毒症心功能障碍组患者左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室缩短分数（Left ventricular fractional shortening,LVFS）、左室舒张末内径（Left ventricular end diastolic diameter,LVEDD）明显降低;与脓毒症组相比,脓毒症心功能障碍组患者NT-pro BNP、CK-MB及UCP2水平明显升高。其中,UCP2水平与NT-pro BNP、c Tn I、CK-MB水平显著正相关（P＜0.05）。在多因素二元Logistic回归中,NT-pro BNP/100（OR=1.009,95%CI1.002-1.015,P=0.001）,及UCP2（OR=1.755,95%CI 1.043-2.956,P=0.034）是脓毒症心功能障碍的独立危险因素。发生脓毒症心功能障碍患者的UCP2及NT-pro BNP、c Tn I、CK-MB水平较入ICU时明显升高。小结:UCP2水平在早期脓毒症心功能障碍患者血浆中升高,与NT-pro BNP水平显著正相关,且为脓毒症发展为脓毒症心功能障碍的独立危险因素,但对脓毒症发生脓毒症心功能障碍的预测价值差。第二部分左西孟旦减轻脂多糖诱导的脓毒症小鼠心功能障碍的作用机制目的:观察左西孟旦对脓毒症心功能障碍C57BL/6J小鼠心脏功能的影响。方法:本部分实验选取健康清洁级雄性C57BL/6J小鼠,分两部分进行。由于预实验发现给予LPS后小鼠脓毒症心功能障碍发病率约为50%,因此取18只小鼠用于第一部分实验,分为二组,对照（Control）组6只,LPS所致心功能障碍（LPS）组12只。LPS组给予腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）10mg/kg复制脓毒症心功能障碍模型,观察LPS注射后小鼠发生脓毒症心功能障碍24小时内心功能变化。取36只小鼠用于第二部分实验,分为四组,对照（Control）组、左西孟旦（Levo）组、LPS所致心功能障碍（LPS）组、LPS+Levo组。对照组及Levo组每组6只,LPS及LPS+Levo组每组12只。LPS组:给予腹腔注射LPS 10mg/kg复制脓毒症心功能障碍模型。随后,LPS腹腔注射3小时小鼠发生脓毒症心功能障碍后给予左西孟旦腹腔注射干预。腹腔注射LPS 6小时后心脏超声观察左西孟旦对脓毒症心功能障碍小鼠心功能的影响,留取小鼠血浆检测心肌酶c Tn I、CK-MB水平、血浆中炎症因子肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）以及血浆中氧化应激因子丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、Cu Zn-超氧化物歧化酶（Cu Zn-Superoxide dismutase,Cu Zn-SOD）水平及血浆中UCP2水平。处死小鼠,留取心脏组织备用。苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色观察小鼠心肌组织形态学变化。结果:1.LPS腹腔注射3小时后小鼠出现精神萎靡不振,毛发竖立松乱,活动减少,动作迟缓,进食饮水减少,对刺激反应性减弱,心率加快,寒战,眼睑部出现粘稠分泌物,腹泻等脓毒症表现,超声心动图LVEF及LVFS显著下降,6小时LVEF及LVFS降至最低,12小时LVEF及LVFS恢复至正常水平。2.与Control组小鼠相比,Levo组小鼠一般状态无明显改变,LPS组小鼠出现精神萎靡不振,毛发竖立松乱暗淡,活动减少,动作迟缓,进食饮水减少,对刺激反应性减弱,寒战,眼睑部出现粘稠分泌物,腹泻等脓毒症表现。LPS+Levo组小鼠精神萎靡较LPS组减轻,活动较LPS组增多,对刺激反应较LPS组增强。3.与Control组相比,Levo组小鼠超声心动图提示LVEF及LVFS水平无明显改变,LPS组小鼠心脏超声提示LVEF及LVFS显著下降。与LPS组相比,LPS+Levo组小鼠的LVEF及LVFS显著升高。4.与Control组相比,Levo组小鼠炎症因子TNF-α、IL-1β水平无明显改变,LPS组TNF-α、IL-1β水平显著升高。与LPS组相比,LPS+Levo组小鼠的TNF-α、IL-1β水平显著下降。5.与Control组相比,Levo组小鼠心肌酶CK-MB、c Tn I水平无明显改变,LPS组CK-MB、c Tn I水平显著升高。与LPS组相比,LPS+Levo组小鼠的CK-MB、c Tn I水平显著下降。6.与Control组相比,Levo组小鼠氧化应激指标MDA、GSH-Px、Cu Zn-SOD水平无明显改变,LPS组小鼠MDA水平显著升高,GSH-Px、Cu Zn-SOD水平显著降低。与LPS组相比,LPS+Levo组小鼠的MDA水平下降,GSH-Px、Cu Zn-SOD水平升高。7.与Control组相比,Levo组小鼠血浆UCP2水平无明显改变,LPS组小鼠UCP2水平显著升高。与LPS组相比,LPS+Levo组小鼠血浆UCP2水平进一步升高。8.与Control组相比,Levo组小鼠心肌组织形态无明显改变,LPS组小鼠出现心肌组织损伤,光镜下观察可见心肌颗粒样变性,间质水肿,炎性细胞浸润等改变;心肌组织坏死评分及炎细胞浸润评分均显著高于对照组。与LPS组相比,LPS+Levo组显著改善了小鼠心肌组织形态学的改变,心肌组织坏死评分及炎细胞浸润评分显著下降。小结:LPS腹腔注射制备脓毒症心功能障碍小鼠模型能够模拟临床脓毒症心功能障碍,LPS腹腔注射后3小时小鼠心功能下降,6小时最低,12小时可恢复。左西孟旦24μg/kg腹腔注射可能通过提高小鼠血浆UCP2水平,改善氧化应激水平,从而改善小鼠的心脏功能及形态。第三部分PINK-1/Parkin通路在左西孟旦减轻小鼠脓毒症心功能障碍的作用研究目的:第二部分研究发现,左西孟旦可改善脓毒症心功能障碍小鼠的心功能并促进血浆UCP2的表达,考虑左西孟旦可能对心脏组织线粒体功能产生影响。本部分实验通过应用左西孟旦,观察脓毒症心功能障碍小鼠心脏组织线粒体形态及其相关蛋白的表达情况,明确左西孟旦是否可以通过调控线粒体动力学及随后的自噬信号通路达到保护心肌的作用。方法:实验选取健康清洁级雄性C57BL/6J小鼠36只,分为四组,对照（Control）组、左西孟旦（Levo）组、LPS所致心功能障碍（LPS）组、LPS+Levo组。对照组及Levo组每组6只,LPS及LPS+Levo组每组12只。LPS组:给予腹腔注射LPS 10mg/kg复制脓毒症心功能障碍模型。随后,LPS腹腔注射3小时小鼠发生脓毒症心功能障碍后给予左西孟旦腹腔注射干预。LPS腹腔注射后6小时处死所有小鼠,立即取出心脏标本,置于冰上,并于显微镜下留取心室组织进行透射电镜检查。应用免疫荧光检测小鼠心肌微管相关蛋白轻链3（Microtubule-associated protein light chain 3,LC3）的表达,同时应用western blotting检测小鼠心肌组织UCP2、线粒体磷酸化动力蛋白相关蛋白-1（Phosphor-dynamin-relatedprotein-1,p-DRP-1）、总动力蛋白相关蛋白-1（Total-dynamin-relatedprotein-1,t-DRP-1）、LC3Ⅱ/Ⅰ,E3泛素蛋白连接酶（E3 ubiquitin-protein ligase,Parkin）及PTEN诱导激酶-1（PTEN-induced kinase-1,PINK-1）蛋白表达。结果:1.应用透射电子显微镜对小鼠心肌线粒体的超微结构进行观察。与Control组相比,Levo组线粒体形态无明显改变,LPS组线粒体形态发生改变,心肌细胞胞质水肿严重,细胞内基质明显减弱,局部增生,线粒体肿胀变大变圆,线粒体膜受损,线粒体嵴排列不规则,内嵴破裂,基质变浅,并出现空泡变性。与LPS组相比,LPS+Levo组镜下可见:心肌细胞细胞胞质中度水肿,胞内基质轻度变轻,线粒体中度肿胀,部分线粒体内嵴变短变少,基质变浅,较LPS组有所改善。2.与Control组相比,Levo组心肌线粒体相关蛋白:UCP2、p-Drp-1/t-Drp-1表达无明显改变,LPS组UCP2、p-Drp-1/t-Drp-1明显升高。与LPS组相比,LPS+Levo组UCP2表达进一步升高,p-Drp-1/t-Drp-1表达下降。3.与Control组相比,Levo组心肌线粒体自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达无明显改变,LPS组LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显升高。与LPS组相比,LPS+Levo组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达进一步升高。4.与Control组相比,Levo组心肌线粒体自噬通路相关蛋白:PINK-1、Parkin蛋白表达无明显改变,LPS组PINK-1、Parkin蛋白表达明显升高。与LPS组相比,LPS+Levo组PINK-1、Parkin蛋白的表达进一步升高。小结:脓毒症心功能障碍小鼠心肌线粒体形态发生改变,左西孟旦可改善脓毒症心功能障碍小鼠心肌线粒体形态。脓毒症心功能障碍小鼠心肌线粒体分裂及自噬增强。左西孟旦可促进脓毒症心功能障碍小鼠心肌线粒体自噬,抑制心肌线粒体分裂,并可能通过PINK-1/Parkin依赖线粒体自噬通路促进脓毒症心功能障碍小鼠线粒体自噬。第四部分线粒体自噬抑制剂在左西孟旦对脓毒症心功能障碍小鼠心肌保护中的作用目的:第三部分研究发现,左西孟旦能够改善脓毒症心功能障碍小鼠心肌线粒体形态,并通过PINK-1/Parkin依赖性线粒体自噬通路增强线粒体自噬。本部分实验旨在通过加入Mdivi-1,线粒体自噬抑制剂,明确左西孟旦对脓毒症心功能障碍小鼠的保护作用是否通过线粒体自噬进行的。方法:实验选取健康清洁级雄性C57BL/6J小鼠42只,分为四组:对照（Control）组、LPS所致心功能障碍（LPS）组、LPS+左西孟旦（Levo）组、LPS+Levo+Mdivi-1组。对照组6只小鼠,LPS组、LPS+Levo组及LPS+Levo+Mdivi-1组每组12只小鼠。LPS组:腹腔注射LPS 10mg/kg,制备脓毒症心功能障碍小鼠模型。LPS+Levo组于LPS腹腔注射3小时后发生心功能障碍小鼠给予左西孟旦24ug/mg,LPS组给予同等剂量0.9%生理盐水腹腔注射作为对照观察,LPS+Levo+Mdivi-1组在给予腹腔注射LPS10mg/kg前1小时给予Mdivi-1 25 mg/kg腹腔注射,LPS腹腔注射3小时发生心功能障碍小鼠给予左西孟旦24μg/kg腹腔注射。LPS腹腔注射后6小时行心脏彩超检查,抽取血标本,处死小鼠,立即取出心脏标本,置于冰上,留取部分心室组织进行透射电镜检查,部分心室组织进行病理形态分析。应用免疫荧光检测小鼠心肌LC3的表达,同时应用western blotting检测小鼠心肌组织线粒体LC3Ⅱ/Ⅰ、Parkin、PINK-1蛋白表达。结果:1.与LPS+Levo组相比,LPS+Levo+Mdivi-1组小鼠LVEF及LVFS显著下降。2.与LPS+Levo组相比,LPS+Levo+Mdivi-1组小鼠血浆心肌酶CK-MB、c Tn I水平升高。3.与LPS+Levo组相比,LPS+Levo+Mdivi-1组小鼠血浆炎症因子TNF-α、IL-1β水平升高。4.与LPS+Levo组相比,LPS+Levo+Mdivi-1组小鼠氧化应激因子MDA水平升高,GSH-Px,Cu Zn-SOD水平降低。5.与LPS+Levo组相比,LPS+Levo+Mdivi-1组小鼠心肌组织颗粒样变性,间质水肿,炎性细胞浸润加重,心肌组织坏死评分及炎细胞浸润评分升高。6.与LPS+Levo组相比,LPS+Levo+Mdivi-1组小鼠心肌细胞胞质水肿进一步加重,细胞内基质明显减弱,局部增生,线粒体肿胀变大变圆,线粒体膜受损,线粒体嵴排列不规则,内嵴破裂,基质变浅,空泡变性加重。7.与LPS+Levo组相比,LPS+Levo+Mdivi-1组小鼠心肌组织线粒体自噬相关蛋白LC3表达明显下降。8.与LPS+Levo组相比,LPS+Levo+Mdivi-1组小鼠心肌组织线粒体自噬相关相关通路蛋白PINK-1及Parkin的表达明显降低。小结:Mdivi-1能够通过PINK-1/Parkin线粒体自噬通路,阻断左西孟旦对LPS小鼠心脏线粒体自噬的增强作用,从而降低左西孟旦对脓毒症心功能障碍小鼠的心功能改善及心肌保护作用。结论:1.UCP2水平在早期脓毒症心功能障碍患者血浆中升高,与NT-pro BNP水平显著正相关,且为脓毒症发展为脓毒症心功能障碍的独立危险因素,但对脓毒症发生脓毒症心功能障碍的预测价值差。2.通过给予C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS的方法可以模拟临床脓毒症心功能障碍模型。脓毒症心功能障碍小鼠出现血浆UCP2水平升高,与临床观察到的现象相符合。脓毒症心功能障碍小鼠出现心功能下降,血浆心肌酶水平升高,同时炎症反应及氧化应激反应加重,心肌线粒体形态发生变化,线粒体自噬及分裂增强。3.应用左西孟旦可通过改善脓毒症心功能障碍小鼠心肌线粒体形态损伤,减轻脓毒症心功能障碍小鼠血浆炎症反应及氧化应激反应,抑制心肌线粒体分裂,促进心肌线粒体自噬从而改善脓毒症心功能障碍小鼠所致的心功能障碍。4.Mdivi-1能够通过PINK-1/Parkin线粒体自噬通路,阻断左西孟旦对LPS小鼠心脏线粒体自噬的增强作用,从而降低左西孟旦对脓毒症心功能障碍小鼠的心功能改善及心肌保护作用。