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利用Cre/loxP系统介导的重组反应用于制备转基因定点整合山羊,已经在重组人溶菌酶转基因山羊的胎儿成纤维细胞内得到初步验证,并制备出了sCT和hSA转基因定点整合山羊。但因胎儿成纤维细胞存在取材困难、性别和转基因整合需要做准确鉴定等问题,该方法尚需做进一步完善。成体细胞取材方便,可弥补胎儿细胞的不足。为探索利用成体成纤维细胞制备转基因定点整合山羊的可行性,本文利用人溶菌酶转基因山羊的耳皮成纤维细胞开展了抗血管内皮生长因子单克隆抗体(Avastin)和人乳铁蛋白(hLF)两种mini基因的定点整合山羊研究,探索在成体细胞中实现转基因定点整合的方法,优化转基因定点整合成体细胞的体细胞核移植方案。分离3月龄的重组人溶菌酶转基因山羊3-415的耳皮成纤维细胞。鉴定该细胞的基因组中loxP序列,框架为5’-[loxP1→-neo-TK-loxP→]-[人溶菌酶表达框架]-3’。获得了重组人溶菌酶转基因山羊3-415的耳皮成纤维细胞系。构建框架为5’-[loxP2→-polyA-Avastin-blg-Puro-loxP→]-3’的Avstin乳腺特异表达载体(pTM-Asn)。其中loxP的突变体loxP1和loxP2分别为LE突变体和RE突变体。将定点整合载体稳定转染成体成纤维细胞,采用两种方法引入Cre酶：①利用脂质体法将Cre真核表达载体pBS185与定点整合载体pTM-Asn共转染3-415耳皮成纤维细胞,定点整合效率为23.08%(6/26)；②利用TAT-Cre蛋白转导法,在脂质体法将pTM-Asn转染细胞后加入200μg/mL TAT-Cre酶处理以介导定点整合,定点整合效率为13.64%(3/22)。由此可见,7BS185与定点整合载体共转染的方法实现定点整合的效率较高。结果表明,利用成体成纤维细胞和Cre/loxP系统实现了目的基因的定点整合,获得了Avastin基因定点整合的、可用于SCNT的单克隆细胞株。另构建框架为5’-[loxP2→-polyA-hLf-blg-Puro-loxP→]-3’的人乳铁蛋白特异表达载体(pTM-hLf),采用整合效率较高的pBS185与定点整合载体共转染法,将pTM-hLf转染到3-415耳皮成纤维细胞中,用嘌呤霉素筛选8～10 d得到细胞克隆后,经逐级扩大培养到6孔板,挑生长状态良好的单克隆细胞株,用PCR及测序鉴定。结果表明,利用成体成纤维细胞和Cre/loxP系统获得了hLf因定点整合的、可用于SCNT的单克隆细胞株。在Avastin和hLf阳性单克隆细胞株中,分别选取1株生长状态最好的进行核移植研究,检测核移植融合率,将重构胚移植到受体羊的子宫内,移植30天后,B超妊娠检查受体山羊怀孕率。Avastin-hlz单克隆细胞株的核移植融合率为89.29%(500/560),怀孕率为25.45%(14/55),hLf-hlz单克隆细胞株的核移植融合率为77.72%(471/606),怀孕率为20.83%(10/48),可见两种构件定位整合细胞的体细胞克隆胚胎有相似的早期妊娠率,该效率符合本牧场体细胞克隆羊的效率范围(14.4-42.9%)。取Avastin山羊和hLf流产胎儿组织利用PCR分别检测Avastin和hLf结果发现定点整合了目的基因。在成体细胞中,Cre/loxP系统同样可以高效率的介导转基因的定点整合,不同类型的目的基因的重组效率无明显差异,所获得的定点整合细胞对体细胞克隆效率无显著影响。同时,本研究得到了阿瓦斯汀基因定点整合细胞系及山羊和人乳铁蛋白基因定点整合细胞系及山羊胎儿,为获得高表达阿瓦斯汀和人乳铁蛋白山羊奠定了基础。