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丙氨酸脱氢酶是一种NAD+依赖性的脱氢酶,它可以催化丙氨酸氧化脱氨生成丙酮酸,同时还原NAD+生成NADH,它是氨基酸代谢和糖代谢中重要的催化酶,其催化产物丙酮酸在工、农、医药等方面有广泛的应用。极端环境中克隆获取嗜碱丙氨酸脱氢酶,通过对蛋白结构解析探索酶蛋白对极端环境下的催化反应机制,为定向改造酶蛋白提供条件。通过氨基酸序列的比对,推测Lys73可能也位于催化中心,实验中对此位点进行突变Ald K73A,以确定Lys73在底物识别中的作用。嗜碱性假坚强芽孢杆菌OF4的丙氨酸脱氢酶的基因Ald克隆到pET-22b(+)载体,转入E.coli BL21(DE3)进行表达。所收集菌体经高压破碎、镍亲和层析和离子交换层析后获得纯度95%的蛋白。Ald蛋白采用悬滴法,利用试剂盒进行结晶条件的筛选和优化。对晶体结晶温度、pH、沉淀剂的种类和浓度等条件的进行梯度优化,并对晶体进行添加剂的筛选,最终确立蛋白浓度为10mg/mL,最佳结晶条件为：0.1M Tris-HCl pH 8.0, 0.1 M LiSO4,22% (w/v) PEG 4000,0.05 M NAD+,20% (W/V) Benzamidine hydrochloride 0.22 μL,温度为16℃,最终获得块状晶体。丙氨酸脱氢酶突变体Ald K73A,点突变后测序正确的质粒转入E.coli BL21(DE3)进行表达。收集菌体经高压破碎、镍亲和层析和离子交换层析后获得纯度95%的蛋白,收集储存用于结晶实验。对晶体结晶温度、pH、沉淀剂的种类和浓度等条件的进行梯度优化,最终确立蛋白浓度：10mg/mL,结晶溶液为：2 M Ammonium sulfate,25% w/v PEG3350,0.05 M NAD+,0.1 M HEPES, pH7.5,.X-射线衍射率4.0 A。利用室内光源(Rigaku R-AXIS VI++Cu靶Ka radiation λ=1.5418 A)对丙氨酸脱氢酶Ald晶体进行数据收集,x射线衍射率达到2.5 A。初步分析数据,得知属于PJ空间群,晶胞参数为a=87.81 A,b=105.42 A,c=119.6A,α=87.83°,β=79.03°,λ=82.38°。以p. Lapideum的丙氨酸脱氢酶的分子结构为初始模型,使用分子置换法对目的蛋白进行结构解析,初步确定每个分子有8-12个亚基,但是未能确定其相位,结构未能解析。本实验初步确定丙氨酸脱氢酶Ald及其突变体Ald K73A的结晶条件,并且对X射线衍射数据进行初步分析,为结构的解析奠定了基础,为我们理解其生物学功能以及定向的人工改造提供重要信息,并可应用于基因工程菌的构建提供依据。