子痫前期(Preeclampsia, PE)属于妊娠高血压疾病，是妊娠期特有疾病。它是以妊娠20周以后高血压（BP≥140/90mmHg）、水肿、蛋白尿(尿蛋白≥0.3g/24h或随机尿蛋白+)为主要临床表现的胎盘综合征，是导致围生儿和孕产妇发病和死亡的主要原因，目前国外发病率为5%-8%，国内为9.4%。目前虽已发现子痫前期的发病与胎盘因素、免疫因素、血管因素、遗传因素等均密切相关，但迄今为止子痫前期的发病机制尚未完全阐明。胎盘是妊娠期母胎的直接接触面。由于子痫前期临床症状在分娩后迅速消失（包括胎盘移除后），因此针对胎盘因素的研究成为子痫前期发病机制研究的热点。滋养细胞是胎盘的主要细胞类型，其向母体子宫内膜和肌层的侵袭、增殖和迁移对胎盘形成和胚胎着床至关重要。已有研究表明滋养细胞侵袭不足和子宫螺旋动脉重铸不完全导致的胎盘浅着床、胎盘缺血与子痫前期的发病相关。Wnt信号通路是自然界普遍存在且非常保守的信号通路，是调控细胞生长发育、增殖、迁徙和分化的关键信号通路之一，在多种肿瘤中均存在Wnt信号通路的异常。Wnt2b/Wnt13是经典Wnt通路的始动因子之一，通过激活经典Wnt信号通路来抑制细胞凋亡、促进细胞侵袭和血管生成等作用而参与肿瘤的进展。Wnt抑制因子1（Wnt inhibitory factor-1，WIF-1）属于分泌型卷曲相关蛋白家族，通过与Wnt配体竞争结合Frizzled受体从而阻断Wnt信号通路。E-钙粘连蛋白（E-cadherin，E-cad）是胞膜上重要的细胞粘附分子和信号转导分子，是反映细胞侵袭性的主要指标，通过与细胞内的β连环蛋白（β-catenin）结合形成复合体以降低其胞内浓度，从而抑制Wnt信号通路。最近研究表明Wnt信号通路参与人类滋养细胞的分化及侵袭过程，但利用大样本量的胎盘组织样本研究以上三种因子与子痫前期的关系还未见报道。而子痫前期胎盘组织芯片的构建为子痫前期蛋白质的表达研究提供了高效、重复性好、外界影响因素最小的检测工具。本课题利用两种类型的的胎盘组织芯片，即绒毛滋养细胞（villouscytotrophoblast，VCT）和绒毛外滋养细胞（extrovillous cytotrophoblast，EVCT）组织芯片检测正常晚孕组和子痫前期组Wnt2b、WIF-1和E-cad蛋白的表达，分析其在正常晚孕组和子痫前期及其不同分型中的表达变化，然后利用Real-timePCR检测两组胎盘组织中Wnt2b、WIF-1和E-cad mRNA的表达，初步探讨Wnt信号通路中Wnt2b、WIF-1和E-cad的表达与子痫前期发病的相关性。目的本课题利用免疫组化（immunohistochemistry，IHC）、VCT和EVCT组织芯片技术检测正常晚孕组和子痫前期组产妇胎盘组织中Wnt2b、WIF-1和E-cad的蛋白表达情况，然后利用Real-time PCR检测正常晚孕组和重度子痫前期组产妇胎盘组织中Wnt2b、WIF-1和E-cad的mRNA表达情况，初步探讨Wnt信号通路中上述三种因子在子痫前期发病机制中的作用。材料和方法1研究对象1.1Real-time PCR研究对象收集2011年12月到2012年12月间在郑州大学第三附属医院住院，临床诊断为重度子痫前期的患者胎盘30例作为病例组，正常足月妊娠妊娠产妇胎盘30例作为正常对照组用于mRNA的检测；1.2组织芯片研究对象河南省妇幼健康转化医学工程实验室收集2007年12月到2010年12月间在郑州大学第三附属医院住院，临床诊断为子痫前期的患者胎盘80例，同期正常晚孕产妇胎盘58例用于子痫前期胎盘绒毛滋养细胞（VCT）和绒毛外滋养细胞（EVCT）组织芯片的构建。利用胎盘组织芯片进行蛋白表达的检测。1.3研究对象入选标准重度子痫前期的诊断标准严格按照2002年美国妇产科学协会和人民卫生出版社出版的第七版《妇产科学》的诊断标准。所有入选对象均为剖宫产、单活胎，排除合并原发性高血压、肾病、糖尿病、抗磷脂综合征、多囊卵巢综合征、胎儿畸形以及其他妊娠合并症病史。2胎盘组织芯片情况2.1组织芯片的验证通过波形蛋白、细胞角蛋白和HLA-G抗体免疫组化染色验证VCT和EVCT组织芯片，结果显示：组织芯片中VCT细胞角蛋白阳性，波形蛋白染色阴性，符合VCT组织的特点；EVCT细胞角蛋白染色阳性，波形蛋白染色阴性，HLA-G染色阳性，符合EVCT组织的特点。这表明胎盘组织芯片是成功构建的。2.2组织芯片H&E染色结果H&E染色表明：VCT组织芯片中98.98%（97/98）的样本保留有目的组织且染色效果好，即在VCT组织芯片上能分析56例子痫前期（其中按病情程度划分包括：重度PE48例，轻度PE8例；按发病时间划分包括：早发型PE41例，晚发型PE15例）和42例正常对照组胎盘组织样本；EVCT组织芯片中86.36%（76/88）的样本保留有目的组织且染色效果好，即在EVCT组织芯片上能分析47例子痫前期(其中按病情程度划分包括：重度PE44例，轻度PE3例；按发病时间划分包括：早发型PE38例，晚发型PE9例)和29例正常对照组胎盘组织样本。由于VCT和EVCT组织芯片中轻度PE和晚发型PE样本例数不足，因此重点分析组织芯片中重度PE和早发型PE中蛋白质的表达。3实验方法3.1利用免疫组化、组织芯片技术检测Wnt2b、WIF-1和E-cad在胎盘组织中的定位和表达将胎盘VCT和EVCT组织芯片切至4μm厚切片，免疫组化检测Wnt2b、WIF-1和E-cad蛋白在两种组织芯片中正常晚孕组和子痫前期组胎盘组织中的定位和表达。3.2Real-time PCR检测正常晚孕组和重度子痫前期组胎盘组织中Wnt2b、WIF-1和E-cad mRNA的表达Trizol法提取胎盘中的总RNA后反转录为cDNA，采用染料法进行实时荧光定量PCR。以三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参基因。采用2-ΔΔCT法分析Wnt2b、WIF-1和E-cad mRNA在正常晚孕和子痫前期组胎盘中的相对表达量。4统计学处理所有实验数据均采用SPSS17.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组数据均符合正态分布的计量资料采用独立样本t检验，不符合正态分布的计量资料采用非参数秩和检验。计数资料用率表示，组织芯片的免疫组化结果通过统计每个染色强度等级的例数后，采用有序多分类资料的秩和检验进行两组间的比较。以α=0.05为检验水准。结果1重度子痫前期组和正常对照组产妇一般临床资料的比较重度子痫前期组及正常对照组产妇年龄差异均无统计学意义（P>0.05）。重度子痫前期组产妇收缩压、舒张压和蛋白尿情况显著高于正常对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。重度子痫前期组产妇生产时孕周、新生儿体重均小于正常对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。2重度子痫前期组与正常对照组产妇胎盘组织中Wnt2b、WIF-1及E-cad mRNA的表达两组产妇胎盘组织中均可检测到Wnt2b、WIF-1和E-cad mRNA的表达。重度子痫组中Wnt2b mRNA的相对表达量为0.34±0.21，正常对照组为1.17±0.66，重度子痫前期组中Wnt2b mRNA的表达低于正常对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05)。重度子痫前期组中WIF-1mRNA的相对表达量为1.52±1.09，正常对照组为1.18±0.65，两组比较无统计学差异（P=0.66）。重度子痫组中E-cadmRNA的相对表达量为1.13±0.57，正常对照组为0.43±0.25，重度子痫前期组中E-cad mRNA的表达水平高于正常对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05)。3VCT和EVCT组织芯片中子痫前期组与正常对照组Wnt2b、WIF-1及E-cad蛋白的表达和定位Wnt2b、WIF-1和E-cad蛋白主要表达于胎盘绒毛合体滋养细胞和侵入底蜕膜的绒毛外滋养细胞，Wnt2b主要表达于细胞膜和细胞质中，WIF-1主要表达于细胞膜和细胞外基质中，E-cad主要表达于细胞膜上。IHC显示，VCT和EVCT组织芯片中，子痫前期组中Wnt2b的染色强度明显低于正常对照组，WIF-1和E-cad的染色强度明显高于正常对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.001）。此外，VCT和EVCT组织芯片中重度PE组、早发型PE组中Wnt2b的染色强度明显低于正常对照组， WIF-1和E-cad的染色强度显著高于正常对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论本研究发现，Wnt2b、WIF-1和E-cadherin在人类晚孕期胎盘绒毛合体滋养细胞和侵入底蜕膜的绒毛外滋养细胞中均有表达，胎盘组织中Wnt2b表达降低，WIF-1和E-cadherin表达增加，提示Wnt信号传导通路的活性降低可能与子痫前期的发病相关。