论文部分内容阅读
卵泡闭锁是多因素参与的复杂调控过程,而究其实质就是颗粒细胞的凋亡,而颗粒细胞的凋亡同样存在很多重要的分子机制,有众多受体、分子和细胞因子的参与。NR5A2(nuclear receptor subfamily5, group A, member2)是一种重要的孤儿受体,属于核受体的NR5A亚家族,与体细胞重编程、胚胎发育、类固醇激素生成和癌症发生等有密切关系。在哺乳动物卵巢组织中,NR5A2在颗粒细胞和黄体细胞中特异表达,NR5A2+／-小鼠繁殖力明显下降,颗粒细胞特异性突变(NR5A2gc-/-)小鼠出现排卵障碍,说明NR5A2在哺乳动物繁殖力和卵巢颗粒细胞功能中发挥重要作用,但目前关于猪NR5A2基因方面的研究还未见报道。本实验以二花脸猪为试验材料,采用克隆测序技术获得二花脸猪NR5A2基因序列,利用生物信息学方法分析其序列特征及蛋白结构,并采用real-time PCR技术和Western blot技术检测二花脸猪和商品猪卵巢组织中NR5A2基因和蛋白表达水平,分析了猪卵泡闭锁过程中NR5A2基因表达的变化,利用RNAi技术分析了NR5A2在猪颗粒细胞凋亡中的作用,探讨NR5A2基因与二花脸猪高繁殖力、卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡之间的关系,为揭示二花脸高繁殖力性状形成的分子机制提供参考和理论依据。本文主要研究结果如下：1.二花脸猪NR5A2基因的克隆与序列分析通过克隆测序获得了二花脸猪NR5A2基因编码区全序列,长度为1506bp。同源性分析发现二花脸猪NR5A2基因核苷酸序列与牛、羊等哺乳动物的一致性在75-89%之间,与巴克夏猪的一致性为99.67%,共发现5个突变位点。二花脸猪NR5A2基因编码蛋白含有501个氨基酸,与哺乳动物的一致性在89-95%之间,与巴克夏猪的一致性为99.600%,发现2个氨基酸变异(S175N、N426D).结构域预测发现二花脸猪NR5A2蛋白与人、牛等其它哺乳动物一样,也含有DNA结合域、Ftz-F1盒和配体结合域等保守结构域。以鸡为外类群,构建了哺乳动物8个物种系统发育树,发现聚类结果与经典的分类结果是完全一致的。研究结果表明哺乳动物NR5A2基因在进化上是相当保守的,推测二花脸猪NR5A2基因与哺乳动物其它物种一样在卵泡发育和繁殖力等方面发挥重要作用。2.二花脸猪卵巢组织NR5A2基因和蛋白表达水平分析利用RT-PCR对二花脸猪下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、卵巢、输卵管、子宫等12种组织中NR5A2基因的表达情况进行了检测,结果发现NR5A2基因在二花脸猪12个组织中广泛表达,特别是在卵巢组织中高表达。采用real-time PCR法对二花脸猪与商品猪卵巢组织中NR5A2基因mRNA表达水平进行了分析,结果发现二花脸猪卵巢组织中NR5A2基因mRNA表达水平高于商品猪,差异显著(P<0.05)。采用Western blot方法对二花脸猪与商品猪卵巢组织中NR5A2蛋白水平进行了检测,结果发现二花脸猪卵巢组织中NR5A2蛋白表达水平显著高于商品猪(P<0.05)。研究结果表明卵巢组织中NR5A2基因和蛋白表达水平可能与二花脸猪的高繁殖力有关,是影响二花脸高繁殖力性状形成的候选基因。3.猪卵泡闭锁过程中NR5A2基因表达水平变化用real-time PCR技术对猪健康卵泡(H)、早期闭锁卵泡(EA)和晚期闭锁卵泡(PA)中NR5A2基因mRNA表达水平进行了检测,结果显示健康卵泡中NR5A2基因mRNA表达水平极显著高于早期和晚期闭锁卵泡(p<0.01),但早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡间差异不显著(p>0.05),说明NR5A2基因可能在猪卵泡早期闭锁中发挥作用。另外,对健康卵泡和早期闭锁卵泡中NR5A2基因mRNA表达水平与卵泡液中雌二醇(E2)、孕酮(P4)浓度进行了相关性分析,结果发现猪卵泡NR5A2基因mRNA表达水平与E2浓度呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为0.7496,回归方程为：y=-0.01724+0.00065x(R2=0.56)；NR5A2基因mRNA表达水平与P4/E2呈极显著负相关(P<0.01),相关系数为-0.6833,回归方程为：y=0.28971-0.03301x(R2=0.47)。研究结果表明NR5A2基因与猪卵泡早期闭锁有一定的关系,可能通过影响卵泡液中E2的合成影响卵泡闭锁。4NR5A2在猪卵泡颗粒细胞凋亡中的作用NR5A2-siRNA可有效的抑制猪颗粒细胞中NR5A2基因的表达,颗粒细胞中NR5A2基因的转录水平下调了72.44%。抑制NR5A2基因后颗粒细胞中凋亡相关基因Bcl-2基因mRNA表达水平明显下调,但Bax基因表达水平变化不明显。抑制NR5A2基因后,颗粒细胞中P450arom表达水平下调了44.28%,但与NC-siRNA组相比差异不显著；抑制NR5A2基因后,颗粒细胞中P450scc水平下调了50.31%,与NC-siRNA组相比,差异极显著(P<0.01)。研究结果表明NR5A2基因在猪卵泡颗粒细胞凋亡中有重要的调控作用。