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目的
遗传性凝血因子Ⅻ（coagulationfactorⅫ，FⅫ）缺陷症主要是由于F12基因突变引起的一种非常少见的常染色体隐性遗传性疾病，部分患者可表现为显性遗传，最早于1955年由Ratnoff报导。近年来国内外研究者相继报道了许多F12基因的新突变位点，这些突变位点的发现为FⅫ缺陷症患者发病机制的研究奠定了基础。本研究通过对两个由于近亲结婚而导致的遗传性FⅫ缺陷症家系进行实验室表型和F12基因突变检测，用生物信息软件分析突变的保守性及危害性，初步探讨其分子发病机制。
方法
1、资料
家系A:先证者，女，26岁，因第2次妊娠4个月，到我院进行常规孕检。凝血常规检查发现其活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplastintime，APTT）延长至61.6s（正常参考值：29.0～43.0s），该延长能被正常混合血浆纠正；纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）轻度升高，凝血酶原时间（prothrombintime，PT）、凝血酶时间（thrombintime，TT）均在正常范围。凝血因子功能检测发现其FⅫ活性（FⅫactivity，FⅫ:C）仅12%（正常参考值：72%～113%），FⅫ抗原（FⅫantigen，FⅫ:Ag）为10%（正常参考值：72%～113%），其它内源途径凝血因子活性均在正常参考范围内。家系B:先证者，女，48岁，门诊痔疮手术前进行常规凝血功能检查时，发现APTT明显延长至116.4s，凝血因子功能检测发现其FⅫ:C仅为2%，FⅫ:Ag为1%，其它内源途径凝血因子活性均在正常参考范围内。2例先证者均无高血压、糖尿病、心脏病等病史，肝肾功能正常。家系A共有3代10名成员，家系B共有3代6名成员，平时均无出血及血栓等相关病史，且两个先证者父母均为姨表近亲结婚。
2、实验室表型检测
采用一期凝固法在STA-R全自动血凝仪（法国STAGO公司，STAGO配套试剂）上检测APTT、PT、TT、FIB、FⅫ:C及其他内源途径凝血因子活性；FⅫ:Ag用酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）进行检测。
3、基因检测
依据FⅫ序列（GenBank:AF538691.1），用PrimerPremier6.0软件设计7对引物，涉及FⅫ14个外显子及侧翼序列，包括5’和3’端非翻译区。采用聚合酶链反应（polymersechainreaction，PCR）进行扩增。扩增产物采用DNA直接测序法分析先证者F12基因的全部外显子、侧翼序列、5’和3’端非翻译区及家系成员相应的突变位点区域，发现突变位点后用反向测序予以证实。
4、数据分析
突变位点的保守性采用多重序列比对软件ClustalX进行分析；并采用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和MutationTaster四个生物信息学评分软件同时分析突变对蛋白质功能的影响。
结果
1、遗传性FⅫ缺陷症家系实验室表型检测结果
家系A:先证者（Ⅳ2）和其哥哥（Ⅳ1）APTT分别为61.6s和68.6s，均明显延长；两者的FⅫ:C分别为12%和11%，FⅫ:Ag均为10%，均显著降低。家系其他成员中，祖母（Ⅱ1）、外祖母（Ⅱ2）、父亲（Ⅲ2）、母亲（Ⅲ6）、大姑（Ⅲ1）和大姨（Ⅲ5）APTT都在正常范围内，但FⅫ:C和FⅫ:Ag均约为正常值的一半左右，其它凝血相关指标均无明显异常。先证者小姑（Ⅲ3）和大舅（Ⅲ4）各项指标均无明显异常。
家系B：先证者（Ⅳ2）及其弟弟（Ⅳ1）APTT分别为116.4s和101.3s，均明显延长；两者的FⅫ:C均为2%，FⅫ：Ag均为1%，均明显下降。家系成员中，先证者父亲（Ⅲ1）APTT略延长，为48.8s，家系其他成员APTT无明显延长；除先证者丈夫（Ⅳ3）外，其他家系成员的FⅫ:C和FⅫ：Ag均有不同程度下降。
2、遗传性FⅫ缺陷症家系基因分析结果
家系A:先证者（Ⅳ2）和其哥哥（Ⅳ1）FⅫ第10外显子存在c.1078G>A纯合突变，导致p.Gly341Arg错义突变，FⅫ其它的外显子及其侧翼区和5’、3’端非翻译区均未检测到其它突变；祖母（Ⅱ1）、外祖母（Ⅱ2）、父亲（Ⅲ2）、母亲（Ⅲ6）、大姑（Ⅲ1）和大姨（Ⅲ5）FⅫ第10外显子均存在c.1078G>A（p.Gly341Arg）杂合错义突变；其小姑（Ⅲ3）和大舅（Ⅲ4）两者为野生型。
家系B：先证者（Ⅳ2）及其父亲（Ⅲ1）、弟弟（Ⅳ1）的F12基因启动子区46C/T多态性为T/T型，母亲（Ⅲ2）及儿子（Ⅴ1）均表现为C/T型，其丈夫（Ⅳ3）为C/C型。此外，先证者（Ⅳ2）及其弟弟（Ⅳ1）14号外显子存在c.1681G＞A纯合突变，导致Gly542Ser纯合错义突变；先证者父亲（Ⅲ1）、母亲（Ⅲ2）及儿子（Ⅴ1）均为c.1681G＞A杂合突变。
3、ClustalX软件分析结果显示，Gly341和Gly542在同源物种间高度保守。家系A及家系B四个生物信息学软件对突变的预测结果均一致。家系A：PolyPhen-2评分（0.934分）、PROVEAN评分（-6.214分）均预示为致病突变；MutationTaster评分（0.976分）预示可引起相应疾病；SIFT评分（0.01分）预示可影响蛋白质功能。家系B：PolyPhen-2评分（1.000分）、PEOVEAN评分（-4.975分）均预示此突变为致病突变；MutationTaster评分（0.999分）预示可引起相应疾病；SIFT评分（0.00分）预示可影响蛋白质功能。
结论
1、家系AFⅫ水平降低与其第10号外显子c.1078G＞A突变导致的p.Gly341Arg错义突变有关。家系BFⅫ水平降低与其第14号外显子c.1681G＞A突变导致的p.Gly542Ser错义突变以及46C/T多态性有关。
2、先证者A和先证者B的F12基因纯合错义突变与先证者父母近亲结婚有关。
3、Gly341和Gly542在同源物种间呈高度保守，说明Gly341和Gly542是FⅫ分子的一个重要功能性位点，在FⅫ蛋白质正常功能的发挥中起关键作用。
遗传性凝血因子Ⅻ（coagulationfactorⅫ，FⅫ）缺陷症主要是由于F12基因突变引起的一种非常少见的常染色体隐性遗传性疾病，部分患者可表现为显性遗传，最早于1955年由Ratnoff报导。近年来国内外研究者相继报道了许多F12基因的新突变位点，这些突变位点的发现为FⅫ缺陷症患者发病机制的研究奠定了基础。本研究通过对两个由于近亲结婚而导致的遗传性FⅫ缺陷症家系进行实验室表型和F12基因突变检测，用生物信息软件分析突变的保守性及危害性，初步探讨其分子发病机制。
方法
1、资料
家系A:先证者，女，26岁，因第2次妊娠4个月，到我院进行常规孕检。凝血常规检查发现其活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplastintime，APTT）延长至61.6s（正常参考值：29.0～43.0s），该延长能被正常混合血浆纠正；纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）轻度升高，凝血酶原时间（prothrombintime，PT）、凝血酶时间（thrombintime，TT）均在正常范围。凝血因子功能检测发现其FⅫ活性（FⅫactivity，FⅫ:C）仅12%（正常参考值：72%～113%），FⅫ抗原（FⅫantigen，FⅫ:Ag）为10%（正常参考值：72%～113%），其它内源途径凝血因子活性均在正常参考范围内。家系B:先证者，女，48岁，门诊痔疮手术前进行常规凝血功能检查时，发现APTT明显延长至116.4s，凝血因子功能检测发现其FⅫ:C仅为2%，FⅫ:Ag为1%，其它内源途径凝血因子活性均在正常参考范围内。2例先证者均无高血压、糖尿病、心脏病等病史，肝肾功能正常。家系A共有3代10名成员，家系B共有3代6名成员，平时均无出血及血栓等相关病史，且两个先证者父母均为姨表近亲结婚。
2、实验室表型检测
采用一期凝固法在STA-R全自动血凝仪（法国STAGO公司，STAGO配套试剂）上检测APTT、PT、TT、FIB、FⅫ:C及其他内源途径凝血因子活性；FⅫ:Ag用酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）进行检测。
3、基因检测
依据FⅫ序列（GenBank:AF538691.1），用PrimerPremier6.0软件设计7对引物，涉及FⅫ14个外显子及侧翼序列，包括5’和3’端非翻译区。采用聚合酶链反应（polymersechainreaction，PCR）进行扩增。扩增产物采用DNA直接测序法分析先证者F12基因的全部外显子、侧翼序列、5’和3’端非翻译区及家系成员相应的突变位点区域，发现突变位点后用反向测序予以证实。
4、数据分析
突变位点的保守性采用多重序列比对软件ClustalX进行分析；并采用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和MutationTaster四个生物信息学评分软件同时分析突变对蛋白质功能的影响。
结果
1、遗传性FⅫ缺陷症家系实验室表型检测结果
家系A:先证者（Ⅳ2）和其哥哥（Ⅳ1）APTT分别为61.6s和68.6s，均明显延长；两者的FⅫ:C分别为12%和11%，FⅫ:Ag均为10%，均显著降低。家系其他成员中，祖母（Ⅱ1）、外祖母（Ⅱ2）、父亲（Ⅲ2）、母亲（Ⅲ6）、大姑（Ⅲ1）和大姨（Ⅲ5）APTT都在正常范围内，但FⅫ:C和FⅫ:Ag均约为正常值的一半左右，其它凝血相关指标均无明显异常。先证者小姑（Ⅲ3）和大舅（Ⅲ4）各项指标均无明显异常。
家系B：先证者（Ⅳ2）及其弟弟（Ⅳ1）APTT分别为116.4s和101.3s，均明显延长；两者的FⅫ:C均为2%，FⅫ：Ag均为1%，均明显下降。家系成员中，先证者父亲（Ⅲ1）APTT略延长，为48.8s，家系其他成员APTT无明显延长；除先证者丈夫（Ⅳ3）外，其他家系成员的FⅫ:C和FⅫ：Ag均有不同程度下降。
2、遗传性FⅫ缺陷症家系基因分析结果
家系A:先证者（Ⅳ2）和其哥哥（Ⅳ1）FⅫ第10外显子存在c.1078G>A纯合突变，导致p.Gly341Arg错义突变，FⅫ其它的外显子及其侧翼区和5’、3’端非翻译区均未检测到其它突变；祖母（Ⅱ1）、外祖母（Ⅱ2）、父亲（Ⅲ2）、母亲（Ⅲ6）、大姑（Ⅲ1）和大姨（Ⅲ5）FⅫ第10外显子均存在c.1078G>A（p.Gly341Arg）杂合错义突变；其小姑（Ⅲ3）和大舅（Ⅲ4）两者为野生型。
家系B：先证者（Ⅳ2）及其父亲（Ⅲ1）、弟弟（Ⅳ1）的F12基因启动子区46C/T多态性为T/T型，母亲（Ⅲ2）及儿子（Ⅴ1）均表现为C/T型，其丈夫（Ⅳ3）为C/C型。此外，先证者（Ⅳ2）及其弟弟（Ⅳ1）14号外显子存在c.1681G＞A纯合突变，导致Gly542Ser纯合错义突变；先证者父亲（Ⅲ1）、母亲（Ⅲ2）及儿子（Ⅴ1）均为c.1681G＞A杂合突变。
3、ClustalX软件分析结果显示，Gly341和Gly542在同源物种间高度保守。家系A及家系B四个生物信息学软件对突变的预测结果均一致。家系A：PolyPhen-2评分（0.934分）、PROVEAN评分（-6.214分）均预示为致病突变；MutationTaster评分（0.976分）预示可引起相应疾病；SIFT评分（0.01分）预示可影响蛋白质功能。家系B：PolyPhen-2评分（1.000分）、PEOVEAN评分（-4.975分）均预示此突变为致病突变；MutationTaster评分（0.999分）预示可引起相应疾病；SIFT评分（0.00分）预示可影响蛋白质功能。
结论
1、家系AFⅫ水平降低与其第10号外显子c.1078G＞A突变导致的p.Gly341Arg错义突变有关。家系BFⅫ水平降低与其第14号外显子c.1681G＞A突变导致的p.Gly542Ser错义突变以及46C/T多态性有关。
2、先证者A和先证者B的F12基因纯合错义突变与先证者父母近亲结婚有关。
3、Gly341和Gly542在同源物种间呈高度保守，说明Gly341和Gly542是FⅫ分子的一个重要功能性位点，在FⅫ蛋白质正常功能的发挥中起关键作用。