β-内酰胺酶CTX-M-14基因的基因环境及TEM-57型酶特性研究

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本试验采用细菌分离及生化鉴定等方法对疑似鸡肺炎克雷伯菌进行培养鉴定,用微量稀释法测定了抗菌药物对临床分离的鸡源肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC),并通过β-内酰胺酶基因型检测、基因亚型的分析,确定鸡源肺炎克雷伯菌产β-内酰胺酶的分子类型。为进一步了解产CTX-M-14型ESBL基因的传播机制和基因环境结构,对产CTX-M-14型ESBL基因进行了质粒接合传递试验;对阳性接合子进行质粒抽提并酶切,PBR322载体连接并转化,插入片段确认成功后,送生物公司进行测序,并进行Blast序列比对。最后,对本实验室鉴定保存的含TEM-57型β-内酰胺酶基因的克隆表达菌进行水解试验和抑酶保护试验,检测该型酶对抗生素的水解率和抑制剂与β-内酰胺类药物合用后对该酶的抑酶保护率,旨在为兽医临床合理使用抗生素提供理论依据。鸡源肺炎克雷伯菌耐药表型、基因型检测结果表明,仅有碳青霉烯类(亚胺培南)、头孢吡肟和粘菌素对肺炎克雷伯菌K1株具有较高的抗菌活性;测得肺炎克雷伯菌K1株同时产ESBLs和AmpC酶,所产的ESBLs为CTX-M-14型,所产的AmpC酶为ACT-like衍变型,同时还产TEM-1和SHV-11型广谱β-内酰胺酶。将blaCTX-M-14、blaSHV-11及blaACT-like衍变型的基因序列上传至NCBI获得的基因序列号分别为GU211011、GU211012和GU211014。产CTX-M-14型ESBL基因的质粒接合传递试验结果表明,产CTX-M-14型ESBL基因的阳性菌株能通过质粒接合传递试验传递耐药性,CTX-M-14和TEM-1基因可同时经质粒传递,接合子的耐药表型与供体菌基本保持一致,具有与供体菌相似的耐药表型,仅有个别药物的MIC值较供体菌有所降低。在含头孢噻肟平板上筛选的含CTX-M-14基因片段的阳性转化子对头孢噻肟耐药,而对其它大多数药物表现敏感。产CTX-M-14型ESBL基因的基因环境结果表明,阳性转化子含有2637 bp长度的目的基因序列,经Blast比对得知,该转化子序列的基因环境结构元件包括上游插入序列ISEcp1、-35区和-10区、重复序列IRR、876 bp的CTX-M-14基因开放阅读框及下游插入序列IS903和IRL,将该序列上传至NCBI获基因序列号为HQ650134。TEM-57型β-内酰胺酶特性结果表明,TEM-57型β-内酰胺酶对头孢氨苄的Km值最小,即亲和力最强,对该药物最易水解。舒巴坦和他唑巴坦对阿莫西林的抑酶保护率均最高(分别为87.3%和92.4%)。他唑巴坦对青霉素、阿莫西林、氨苄西林及头孢曲松钠的抑酶保护作用强于舒巴坦,但是他唑巴坦对头孢噻呋钠的抑酶保护作用弱于舒巴坦。
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