多光子显微成像以其非线性和近红外激发的特点,可以实现毫米量级的深层组织成像、获得亚微米量级的空间分辨率,因此在活体动物组织特别是脑科学研究中应用极为广泛,例如神经网络互联描绘、神经元功能研究等。针对不同的应用需求,多光子显微成像目前的发展趋势为获得更高空间分辨率、更大成像视场、更快成像速度以及更深成像深度。尽管最初演示的1700nm波段三光子成像技术的成像深度(表面下1350μm)已经超过了双光子脑成像(表面下1000μm),但依然存在以下问题:1.其深层成像能力并未到达极限,主要受限于深层成像信号耗尽。信号耗尽原因在于:(1)激发光能量耗尽;(2)荧光标记物亮度不足。2.目前主要用于对脑部血管进行成像,并没有发挥其脑部的多结构成像能力。针对以上问题,本论文开展1700 nm波段超快光源研究,分别实现了调谐范围宽、脉冲能量高的1700nm波段飞秒光源,并基于光源开展深层、多结构脑成像应用研究,为脑科学特别是深层脑区研究提供先进成像解决方案。本论文主要工作如下:1.宽带大模场光纤光源建造和多光子显微成像系统优化。利用光纤中孤子自频移(SSFS)效应,建造了高能棒状光纤光源和宽带可调谐光纤光源,棒状光纤光源可在1700 nm波段实现大于100 nJ的单脉冲能量,宽带光纤光源有大于500 nm的调谐范围。2.实验上演示避免浸润重水吸水导致三光子信号下降的技术,避免信号在成像过程中发生衰减。提出并演示了维持荧光信号强度长时间不变的技术。并验证了使用该方法的可靠性,离体和活体的成像结果显示信号可以维持5个小时以上不发生衰减,并且该技术不会对成像信号产生任何影响。本方法使深层脑成像,尤其是涉及大脑内时间动力学研究的实验结果更为准确,实验过程更为简便。3.开发适合多光子深层脑成像的活体样品制备技术详细描述了活体小鼠颅窗制备步骤,通过大量实验经验积累,设计出符合多光子深层脑成像需求的小鼠头环,获得了高质量的颅窗,从而增加了成像深度。4.基于1700 nm波段宽带光源的多光子成像应用。(1)基于棒状光纤光源,使用SR101、Texas red和量子点分别演示了成像深度为1340μm、1650μm和1800μm深的活体小鼠大脑血管的三光子成像。结果表明SR101可以在某些情况下替代Texas red进行深层血管成像,极大节约成本,而量子点可以通过提高浓度的方式探求三光子脑成像深度极限。(2)通过SR 101标记星形细胞,演示了目前成像深度最深(912μm)的三光子活体小鼠大脑星形细胞成像。(3)基于宽带大模场光纤光源,演示了对红荧光蛋白tdtomato和RPE的三光子激发效率测量。实验证明tdtomato荧光蛋白在1620 nm有最大的激发效率,鉴于已有转基因小鼠脑部神经元表达tdtomato红荧光蛋白,该实验将为该类小鼠深层神经细胞三光子成像提供最佳波长选择依据。本论文的创新点如下:1.搭建了基于大模场光纤、调谐范围超过500 nm的宽带可调谐飞秒孤子光源,为荧光标记物1700nm波段不同发射波长激发效率定量对比奠定光源基础。搭建了基于棒状光纤、单脉冲能量超过百纳焦的1700nm波段高能飞秒孤子(目前1700 nm窗口的激发光能量极限)光源,为深层脑成像奠定光源基础。2.提出一种避免浸润重水吸水导致三光子信号下降的技术,可维持多光子信号5小时以上,完全满足深层脑成像的时间需求。3.分别使用Texas red和量子点标记血管,实现了1650μm和1800μm深的活体小鼠大脑血管成像,均为目前在实验上演示的成像深度最深的成像结果。4.首次实现了912μm深的活体小鼠大脑内星形细胞的三光子成像,比已有的双光子星形细胞的成像深度提高了30%。并开发了活体表达荧光蛋白的激发效率测量系统,为表达tdtomato荧光蛋白的大脑神经元细胞深层成像提供波长选择依据。