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目的本研究通过检测RPE-D407细胞株和SD大鼠视网膜的高糖“代谢记忆”中miR-34a、SIRT1、VEGF表达的变化和细胞凋亡情况,以及下调miR-34a水平后这些指标的改变,探讨miR-34a在DR发生发展中的作用,为DR的发病机制及新的治疗手段提供一定理论依据。方法选取293T细胞为工具细胞,分别合成miR-34a、miR-34a-NC目的基因质粒,SIRT1 3’UTR、SIRT1 3’UTR-NC、SIRT1 3’UTR-MU报告基因质粒,miR-146b、miR-146b-NC、TRAF6 3’UTR阳性对照质粒,然后将miRNA质粒和相应的3’UTR报告质粒共转染293T细胞,48h后进行Luciferase检测,进行数据收集和分析。取生长状态良好的RPE细胞,随机分成7组。A组(正常组):5mM正常糖培养8天(4天为1代);B组(早治组):25mM高糖培养6h后,5mM正常糖培养8天;C组(高糖组):25mM高糖培养8天;D组(代谢记忆组):25mM高糖培养4天后,5mM正常糖培养4天;E组(阴性干预组):25mM高糖培养4天后,转染不含miR-34a mimic/inhibitor的转染试剂继续5mM正常糖培养4天;F组(miR-34a mimic组):25mM高糖培养4天后,转染mi R-34a mimic继续5mM正常糖培养4天;G组(miR-34a inhibitor组):25mM高糖培养4天后,转染miR-34a inhibitor继续5mM正常糖培养4天。各组细胞采用RT-qPCR检测miR-34a的表达水平,采用免疫细胞化学法和Western blotting检测SIRT1和VEGF的蛋白含量,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,进行数据归纳和统计学分析。取6周龄体重为200±20g的清洁级雄性SD大鼠60只,随机分成6组。A.正常组(10只);B.早治组(10只);C.糖尿病组(10只);D.代谢记忆组(10只);E.阴性干预组(10只);F.miR-34a inhibitor组(10只)。除正常组外其他各组大鼠均需腹腔注射stz制作糖尿病模型。b组于造模成功后立即开始胰岛素强化治疗,每日早晚8时予中长效胰岛素颈背部皮下注射,单只总用量为6-8iu/d,连续12周,其余各组给予等剂量的生理盐水皮下注射;d组、e组、f组于造模成功6周后开始胰岛素强化治疗,方法同上,连续6周;e组于造模成功6周后进行一次慢病毒空表达载体的玻璃体腔注射;f组于造模成功6周后进行一次mir-34a-5p-inhibition慢病毒表达载体的玻璃体腔注射。玻璃体腔注射一周后,取眼球做冰冻切片,荧光显微镜下观察mir-34a-5p-inhibition慢病毒对大鼠视网膜转染效果。各组大鼠于12周后取眼球和视网膜,采用rt-qpcr检测mir-34a的表达水平,采用免疫组织化学法和westernblotting检测sirt1和vegf的蛋白含量,采用tunel法检测细胞凋亡情况,进行数据归纳和统计学分析。结果luciferase报告基因实验结果显示,mir-34a质粒和sirt13’utr质粒共转染293t细胞后,sirt1的相对表达量相比其他对照组明显降低,有统计学意义。rpe细胞中mir-34a、sirt1、vegf和细胞凋亡数检测结果显示:采用mir-34amimic干预代谢记忆组细胞后,mir-34a表达升高(t=65.035,p<0.01)、sirt1表达降低(t=12.054,p<0.01);采用mir-34ainhibitor干预代谢记忆组细胞后,mir-34a表达降低(t=6.211,p<0.01)、sirt1表达升高(t=10.437,p<0.01)。高糖组相比正常组,mir-34a升高(t=12.717,p<0.01)、sirt1降低(t=32.797,p<0.01)、vegf(t=20.92,p<0.01)和细胞凋亡数升高(t=21.751,p<0.01);早治组与正常组相比无差异(t=0.729,t=0.925,t=0.597,t=0.147,p>0.05);代谢记忆组中mir-34a、vegf和细胞凋亡数,相比高糖组降低(t=4.132,t=4.374,t=5.028,p<0.05),但高于正常组(t=12.181,t=11.745,t=13.93,p<0.01),sirt1相比高糖组升高(t=7.483,p<0.01),但低于正常组(t=23.718,p<0.01)。mir-34ainhibitor组中mir-34a、vegf和细胞凋亡数,相比正常组升高(t=3.347,t=5.514,t=4.409,p<0.05),但低于代谢记忆组(t=6.211,t=5.063,t=6.623,p<0.01)和阴性干预组(t=4.626,t=6.190,t=8.593,p<0.05),sirt1相比正常组降低(t=9.561,p<0.01),但高于代谢记忆组(t=10.437,p<0.01)和阴性干预组(t=11.181,p<0.01)。玻璃体腔注射后视网膜转染率高,荧光显微镜下显示视网膜全层高荧光。大鼠视网膜中miR-34a、SIRT1、VEGF和细胞凋亡数检测结果显示:糖尿病组相比正常组,miR-34a升高(t=10.292,P<0.01)、SIRT1降低(t=18.258,P<0.01)、VEGF(t=12.629,P<0.01)和细胞凋亡数(t=14.295,P<0.01)升高;早治组与正常组相比无差异(t=0.172,t=0.205,t=0.21,t=0.198,P>0.05);代谢记忆组中miR-34a、VEGF和细胞凋亡数,相比糖尿病组降低(t=3.008,t=3.789,t=4.128,P<0.05),但高于正常组(t=7.557,t=14.428,t=15.414,P<0.01),SIRT1相比糖尿病组升高(t=7.19,P<0.01),但低于正常组(t=9.66,P<0.01)。miR-34a inhibitor组中miR-34a、VEGF和细胞凋亡数,相比正常组升高(t=4.255,t=9.096,t=8.773,P<0.05),但低于代谢记忆组(t=3.425,t=5.135,t=6.84,P<0.05)和阴性干预组(t=5.233,t=5.905,t=7.483,P<0.01);SIRT1相比正常组降低(t=5.247,P<0.01),但高于代谢记忆组(t=5.427,P<0.01)和阴性干预组(t=7.259,P<0.01)。结论1.SIRT1是miR-34a的靶基因之一,miR-34a下调SIRT1的表达;2.早期降糖治疗有效,后期控制糖水平至正常,高糖培养的RPE细胞和糖尿病大鼠视网膜中miR-34a、SIRT1、VEGF和细胞凋亡数不能恢复至正常水平。DR存在高糖“代谢记忆”现象;3.miR-34a inhibitor下调miR-34a,通过mi R-34a/SIRT1通路减少VEGF表达和细胞凋亡,即通过下调miR-34a,改变表观遗传,从而部分逆转高糖“代谢记忆”,可能从分子水平上治疗DR。