A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）,旧称塞内卡谷病毒,属于小RNA病毒科塞内卡病毒属。SVA是A型塞内卡病毒相关水疱病（SVA-associated vesiculardisease,SAVD）的病原体,其感染会引起病猪鼻部、口腔和蹄冠处出现特征性水疱病变,同时伴有抑郁、食欲不振、嗜睡、跛行等症状。2014年以来,美国、巴西、泰国、哥伦比亚、越南、中国等多个国家相继报道了 SAVD的发生。2018年,巴西出现了第二次SAVD爆发,其特点是传播迅速,临床表现严重。该疫情的再次发生,提示猪群中持续存在SVA可能会导致病毒进化,使其具有更强的致病性和传播能力。SVA作为猪新发传染病的病原体,我们急需了解该病的发病机制以及病毒早期与宿主细胞之间的相互作用等方面的信息。鉴于此,本研究首先通过转录组学技术分析SVA感染后,宿主细胞在转录水平上的变化情况。随后,运用CRISPR/Cas9技术构建了一组天然免疫基因缺失的猪细胞系,并研究了 SVA、萨佩罗病毒（Porcine sapelovirus,PSV）以及盖塔病毒（Getahvirus,GETV）在这些细胞系上的生长特性。1.A型塞内卡病毒感染的转录组学分析本研究从病毒与宿主细胞相互作用的角度出发,用SVAGD05毒株感染猪肾上皮细胞（LLC-PK1）。感染后6 h和12 h收集样本,进行高通量测序以分析细胞的转录组变化情况。结果显示,与对照组相比,SVA感染后6h,共发现1584个差异表达基因（different expression genes,DEGs）,包括1072个表达上调的基因和512个下调基因。在SVA感染后12 h,发现9785个DEGs,其中表达上调的有5238个,下调的有4547个。GO功能注释和KEGG通路富集分析发现,SVA感染能够引起LLC-PK1细胞中天然免疫、细胞凋亡等多条信号通路发生改变。其中,天然免疫相关信号通路出现显著变化,提示在SVA感染过程中免疫调控机制发挥了重要作用。随后,我们选取了 28个重要的DEGs进行RT-qPCR验证。结果显示,所有DEGs的相对表达倍数变化与RNA-seq结果基本一致。其中,I型干扰素（包括IFN-α和IFN-β）呈现最大幅度上调,其次是RSAD2、DDX58、MX1等抗病毒天然免疫基因。相反,ID2等6个DEGs表达下调或不变。上述结果提示,Ⅰ型干扰素在宿主细胞早期抗病毒感染中起到关键作用,而其他免疫相关基因也发挥了重要功效。2.天然免疫基因及病毒受体缺失细胞系的构建与应用病毒与细胞受体结合是病毒入侵宿主细胞的首要步骤,对于病毒实现成功感染至关重要。先前研究发现,ANTXR1是SVA入侵人源细胞的细胞受体,但猪源ANTXR1是否作为SVA入侵猪源细胞的受体有待鉴定。此外,本研究转录组部分结果显示,SVA入侵宿主细胞之后,显著激活I型干扰素和MX1、RSAD2等的转录表达水平,提示这些抗病毒因子在宿主抵抗SVA感染中发挥了重要功效。Ⅰ型干扰素的产生需要多种天然免疫蛋白的参与,包括RIG-I、IRF3、IRF7、NF-κB、TRIF、MAVS 等。鉴于此,我们首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了敲除ANTXR1和过表达ANTXR1的ST-R细胞。随后,将SVA报告病毒感染上述细胞,通过观察荧光蛋白和测定荧光素酶活性,检测病毒对细胞的感染情况。结果显示,猪源ANTXR1是SVA入侵猪源细胞的细胞受体。其次,我们挑选了 I型干扰素信号通路中几个重要的免疫基因RIG-I、IRF3、IRF7、TRIF及抗病毒因子RSAD2、MX1,利用CRISPR/Cas9技术构建了一组天然免疫基因缺失细胞系。然后将三种猪源病毒（SVA,PSV,GETV）分别感染上述细胞,测定其生长曲线。结果显示,SVA病毒滴度在STRIG-IKO（knockout）,ST IRF7 KO和ST IRF3/IRF7 KO细胞系上显著提升,提示RIG-I和IRF7在宿主细胞拮抗SVA生长复制过程中发挥重要作用。与转录组结果略有不同,SVA病毒滴度在STRSAD2KO、STMX1 KO等细胞系上无明显变化。我们推测基因在细胞水平上抑制SVA生长增殖的能力不仅取决于其在转录水平上的变化幅度,还与它的功能、在免疫信号通路中所处的位置密切相关。同时,运用免疫基因缺失细胞系测定的PSV和GETV生长曲线结果显示,TRIF和IRF7对于抑制PSV和GETV的生长复制具有重要意义。该研究工作旨在从细胞水平上通过敲除单个基因,研究病毒的生长情况,从而阐述基因个体在宿主拮抗病毒生长复制中的作用。同时,本研究为猪源病毒感染提供了切实可用的细胞材料,也为病毒致病机理的研究提供了理论支持。