荧光共振能量转移(FRET)作为一种均相、灵敏的分析技术,在研究生物大分子的结构和功能,及对生物分子进行定量检测等方面受到科研工作者的广泛关注。目前被用作荧光供体的材料包括有机小分子染料,荧光蛋白,量子点,无机上转换荧光纳米颗粒及新近发展起来的碳纳米材料等。而荧光受体则主要是有机小分子染料,碳纳米材料及金和银等贵金属纳米材料等。有机小分子染料是早期FRET体系中常用的荧光受体,但是在使用过程中存在荧光猝灭效率不高,需要标记使实验步骤繁琐等缺点。近年来随着纳米技术的迅速发展,碳纳米材料及金和银等贵金属纳米颗粒等也被发现具有良好的荧光猝灭性质。碳纳米材料包括碳纳米管,碳球及氧化石墨烯等,现已被广泛用作荧光受体构建FRET传感平台,实现了对各种目标物包括核酸、蛋白等生物分子及离子等的高灵敏和高选择性检测。然而碳纳米材料在水中的分散性不好,而且存在较强的非特异性吸附作用。通过引入表面活性剂或极性基团虽然可以改善其在水中的分散性,但是又会对其在生物分析中的应用产生不利影响。因此发展新的荧光受体仍是很有必要的。金及银等贵金属纳米颗粒的摩尔消光系数大,表面等离子吸收光谱宽,对各种荧光材料均表现出良好的荧光猝灭能力。鉴于贵金属钯具有与金和银类似的理化性质,我们推测纳米钯也可被用作为荧光猝灭剂用于FRET体系中。基于此我们分别研究了纳米钯对有机小分子染料,石墨相氮化碳(g-C3N4)纳米片及较难被猝灭的上转换荧光纳米颗粒(UCNPs)的荧光猝灭能力,并由此构建生物传感器实现了对核酸,蛋白及生物小分子的高灵敏检测。另外,我们还比较了纳米钯这种新型能量受体与目前常用的荧光受体—石墨烯的荧光猝灭性能的差异。1.由于纳米钯的紫外可见吸收性质与粒径有关,我们采用晶种生长法合成得到粒径较大的在可见光区有较强吸收的纳米钯,并研究了其对有机小分子染料的荧光猝灭能力。利用单链核酸或由侧链带有氨基的氨基酸残基组成的多肽探针与纳米钯之间的配位作用,可拉近标记在核酸或多肽上的染料与纳米钯之间的距离,我们观察到染料的荧光被纳米钯显著猝灭,猝灭效率可达97%。尤为重要的是,以纳米钯为荧光猝灭剂时不存在非特异性猝灭现象。当加入目标DNA或蛋白酶后,由于探针与目标物优先结合,削弱了探针与纳米钯之间的配位作用,使得染料与纳米钯远离,FRET过程消失,染料的荧光恢复,由此实现对核酸和蛋白等生物分子的超灵敏检测。核酸检测的线性范围从0.003 nM到0.1 nM,该方法与目前不借助于酶放大的FRET技术相比,灵敏度得到显著提高。2.g-C3N4纳米片是最近发现的具有高荧光量子产率的碳纳米材料。由上一章工作可知,g-C3N4纳米片表面带有的含氮官能团可与钯配位,从而起到稳定纳米钯分散的作用。由此我们采用一步还原法合成得到表面负载有纳米钯的g-C3N4纳米片复合纳米材料,并发现复合纳米材料中g-C3N4纳米片的荧光被纳米钯猝灭。鉴于含有巯基的生物分子可以与钯形成稳定的Pd-S键,将半胱氨酸加入至上述复合纳米材料中时,半胱氨酸与钯作用使得纳米钯与g-C3N4纳米片之间的距离变大,FRET效率减小,g-C3N4纳米片的荧光恢复。在1-500 nM浓度范围内,g-C3N4纳米片的荧光恢复程度与半胱氨酸的浓度之间呈线性相关。3. UCNPs是一类较难被猝灭的发光的无机纳米材料,由于FRET的发生需要荧光供受体之间的距离在1到10 nm的范围内,通常UCNPs中位于表面的发光的稀土离子发出的荧光才能被有效猝灭。为了考察纳米钯对UCNPs的荧光猝灭能力,我们首先合成出在可见光区有宽吸收的巯基十一烷酸修饰的纳米钯。利用标准的EDC/NHS偶联法将癌胚抗原核酸适配体标记到己二酸修饰的UCNPs表面,接着与纳米钯混合孵育。由于核酸适配体中的含氮碱基可以与纳米钯配位,拉近UCNPs与纳米钯之间的距离,观察到UCNPs的荧光被纳米钯显著猝灭,猝灭效率可达85%以上。而加入癌胚抗原后,由于癌胚抗原适配体优先与癌胚抗原特异性结合并发生构象变化,削弱了适配体与纳米钯之间的配位作用,使得UCNPs与纳米钯远离,FRET过程消失,UCNPs的荧光恢复。随着癌胚抗原的浓度增加,荧光恢复程度变大。该癌胚抗原传感器在缓冲溶液中检测的线性范围从2pg/mL到100pg/mL,检出限为0.8 pg/mL。同时还实现了对复杂样品血清中CEA的高灵敏检测。4.为了比较纳米钯与目前已有荧光受体的性能差异,本章以UCNPs为荧光供体,被广泛使用的石墨烯为荧光受体,构建UC-FRET传感平台用于卡那霉素的检测。首先将卡那霉素适配体与UCNPs偶联,然后与石墨烯混合,适配体与石墨烯之间的π-π堆积作用拉近了荧光供受体之间的距离,使UCNPs与石墨烯在FRET发生的有效距离内,导致UCNPs的荧光被猝灭。而加入卡那霉素后,由于卡那霉素适配体优先与卡那霉素特异性结合同时伴随着构象变为发卡结构,使得适配体与石墨烯之间的π-π堆积作用变弱,UCNPs从石墨烯表面释放出来,导致FRET过程消失,UCNPs的荧光恢复,由此实现了对缓冲和稀释血清中卡那霉素的检测。5.以石墨烯为荧光受体时,由于非特异性猝灭现象明显,使得信噪比和检测灵敏度均受到限制。而纳米钯作为一种新型的能量受体,不仅荧光猝灭能力强,而且在使用过程中不存在非特异性猝灭现象,在FRET生物传感器中具有广泛的应用前景。