目的本文拟根据生物黏附给药系统的特点,完善黄连提取工艺条件,提高黄连总生物碱的提取率,将黄连总生物碱入药制备成生物黏附栓剂,以期为黄连总生物碱治疗假丝酵母菌性阴道炎及其复发提供一个新的给药系统。方法1.以盐酸小檗碱为对照品,采用紫外分光光度法建立黄连总生物碱含量测定方法;以盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸表小檗碱、盐酸药根碱5种生物碱为对照品,采用HPLC建立黄连中5种主要生物碱的含量测定方法;以总生物碱提取率为评价指标,在单因素试验的基础上,运用正交试验设计,优选水煎提取工艺。2.采用静态吸附和动态吸附考察相结合的方法,以黄连总生物碱为指标筛选6种不同性质的大孔吸附树脂,通过考察上样浓度、上样量、流速、径高比、除杂溶剂、洗脱溶剂等因素,最终确立D101型大孔吸附树脂纯化黄连总生物碱的工艺条件。根据确定的工艺进行工艺放大试验。3.对黄连总生物碱提取物进行性状观察、TLC鉴别、水分检查和重金属含量检查,以及根据不同批次黄连总生物碱提取物含量测定结果制定提取物中黄连总生物碱和5种主要生物碱的含量限度,对黄连总生物碱(提取物)进行质量控制。对黄连总生物碱(提取物)进行稳定性影响因素试验、长期稳定性考察、平衡溶解度测定、表观油水分布系数测定、临界相对湿度测定,以考察其理化性质和稳定性。4.采用体外抑菌法对黄连水提物、黄连醇提物、黄连总生物碱提取物、克霉唑、盐酸小檗碱进行MIC值比较,以初步评价黄连总生物碱的有效性;采用小鼠急性毒性试验初步评价黄连总生物碱的安全性;采用家兔阴道刺激性试验初步评价黄连总生物碱的刺激性。5.采用热熔法手工灌模制备黄连总生物碱阴道黏附栓,以栓剂的外观形态、硬度、融变时限等为考察指标,筛选阴道栓空白基质;以黏附力和溶出度为指标,确定生物黏附剂;进一步采用星点设计,以2h、6h、12h的药物释放量和融变时限为指标确定黄连总生物碱阴道黏附栓的较优处方,并通过外观形状、重量差异、融变时限、主药含量、黏附力对黄连总生物碱阴道黏附栓进行初步的质量评价;采用高温、高湿、强光照试验以初步考察黄连总生物碱阴道黏附栓的稳定性。结果1.建立了黄连总生物碱的紫外分光光度定量分析方法,其检测波长为348nm,黄连总生物碱在2.52～15.12μg·mL-1范围内呈良好的线性关系,精密度、稳定性、重复性、回收率等均符合要求;建立了小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱的HPLC含量分析方法,五种生物碱分别在0.1610～0.9660μg、0.0525～0.5250μg、0.0695～0.6950μg、0.0515～0.5150μg、0.0200～0.4000μg范围内线性关系良好,精密度、稳定性、重复性、回收率试验等均符合要求。确定的黄连总生物碱的提取工艺条件为:以12倍量水,加热回流提取3次,每次1.5h;经三次验证试验总生物碱提取率89.84%,浸膏得率25.32%,总生物碱纯度38.81%,小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱的纯度分别为 22.05%、5.76%、7.59%、3.92%、1.31%。2.黄连总生物碱的纯化工艺条件,即制备浓度为0.25 g生药·mL-1的上样液(黄连总生物碱含量26.70mg·mL-1),加入径高比约1:9的D101大孔吸附树脂柱,以速度1～2BV/h上样约1.2 BV,首先用约2BV纯水进行除杂,再用约2BV 60%乙醇以1～2 BV/h流速洗脱,收集洗脱液,70℃减压浓缩至含黄连总生物碱约150mg·mL-1并以入口温度180℃、25%流速条件进行喷雾干燥后即得黄连总生物碱提取物。纯化后总固化物中黄连总生物碱纯度在60%以上,且转移率达65%以上。3.建立紫外分光光度法和HPLC测定黄连总生物碱提取物中黄连总生物碱及其五种生物碱的含量,线性关系、精密度、稳定性、重复性、回收率等均符合要求;对黄连总生物碱提取物进行质量控制:本品为棕黄色粉末,粉末细腻、气微、味极苦,水分检查低于5%,重金属含量未超过限量标准,其中黄连总生物碱纯度不低于54%,小檗碱不低于27%,巴马汀不低于5.9%,黄连碱不低于9.4%,表小檗碱不低于3.4%,药根碱不低于1%。黄连总生物碱提取物在60℃高温、75%高湿及强光照条件下性质稳定,在甲醇、乙醇、超纯水、生理盐水、人工胃液(pH 1.2)、人工肠液(pH 6.8)中的溶解度分别为317.15±8.60mg·mL-1、273.27±1.57mg-mL-1、157.18±0.78mg·mL-1、20.55±0.79mg·mL-1、322.72±7.10mg·mL-1、283.65±3.71mg·mL-1,pH 7.8、pH7.4、pH 6.8、pH 5.8、pH 5.0、pH 4.5、pH 4.0、pH 2.0的PBS缓冲液中的溶解度分别为340.06±10.97mg·mL-1、359.69±9.68mg·mL-1、384.33±5.16mg·mL-1、346.88±7.42mg·mL-1、339.35±9.04mg·mL-1、374.61±4.68mg·mL-1、372.10±3.71mg·mL-1、265.88±2.20mg·mL-1、254.77±3.69mg·mL-1,其在 pH 1.2 HCl、pH 1.5、pH 2.0、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0、pH 6.8、pH7.4、pH8.0 PBS 中的表观油水分配系数分别为 0.146、0.179、0.104、2.929、0.557、0.438、0.259、0.328、0.107。4.采用体外抑菌法测定黄连水提物、黄连醇提物、黄连总生物碱提取物、克霉唑、盐酸小檗碱的 MIC 值分别为 4.68mg·mL-1、2.34mg·mL-1、1.17mg·mL-1、0.25mg·mL-1、0.25mg·mL-1,黄连总生物碱具有良好的抗假丝酵母菌作用,与盐酸小檗碱相当;采用小鼠灌胃急性毒性试验初步评价黄连总生物碱的安全性,结果显示其对小鼠灌胃给药的 LD50为 1153.99mg·kg-1,95%置信区间为(940.80～1478.26)mg·kg-1;家兔阴道黏膜刺激性试验显示黄连总生物碱组家兔阴道组织无明显病理改变,黄连水提物组有明显的红肿、充血现象,病理结果显示小檗碱组和水提物组均有充血、黏膜剥离现象。5.建立紫外分光光度法和HPLC测定黄连总生物碱阴道黏附栓中主药黄连生物碱的含量,线性关系、精密度、稳定性、重复性、回收率等均符合要求。经单因素及星点设计试验优选得黄连总生物碱阴道黏附栓的最优处方为:黄连总生物碱:12.00%、PEG6000:60.63%、PEG1500:13.80%、HPMC:13.57%,按处方比例组成混合基质制备得到黄连总生物碱阴道黏附栓,平均粒重为2.74g,重量差异在0.00%～3.28%之间,融变时限在45min内,黏附力22～23g·cm-2,其体外释放结果显示在2h、6h、12h时累计释放度分别为39.50%、72.81%、86.38%。结论本文通过单因素及正交试验优选的提取纯化工艺条件稳定可行,重复性好,成本低,适合用于黄连总生物碱(提取物)的工业生产;采用紫外分光光度法和HPLC对黄连总生物碱提取物中指标成分进行质量控制,获得的黄连总生物碱(提取物)中总生物碱的含量在60%以上;其次,采用稳定性影响因素试验和长期稳定性试验确定提取物稳定性良好,理化性质考察表明其易溶于水,易吸湿,具亲水性;通过体外抑菌试验、急性毒性试验和刺激性试验表明黄连总生物碱对假丝酵母菌和光滑酵母菌均有较强的抑制作用,并且安全性好、刺激性小;最后制备了黄连总生物碱阴道黏附栓,经质量评价,各项结果均符合《中华人民共和国药典》(2010版)规定,为研制开发高质量的中药制剂奠定了坚实的基础。