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隐花色素(CRYPTOCHROME,简称CRY)是与DNA光解酶氨基酸序列高度同源的黄素蛋白,但不具有光解酶活性。拟南芥的隐花色素家族有三个成员,其中隐花色素1(CRY1)主要抑制下胚轴伸长,而隐花色素2(CRY2)主要调节光周期开花,并且这两个光受体具有部分冗余的功能。为进一步阐明拟南芥隐花色素的生物学功能,本实验室采用酵母双杂交的方法,以GUS-CCT2为诱饵蛋白筛选拟南芥cDNA文库,筛选到与之相互作用的蛋白RAT1(Related to acyltransferase)。rat1单突变体在长日条件下(16 h光照/8 h黑暗)开花时间与其野生型一致。在sgs3-11突变体中过量表达RAT1的拟南芥转基因植株,在长日条件下开花时间与其野生型一致。共聚焦激光扫描显微镜结果表明GFP-RAT1在细胞质和核中均有表达。通过序列比对发现:RAT2与RAT1的氨基酸序列同源性达89.7%,与γ-型碳酸酐酶基因在同一个进化枝上。rat2单突变体在长日条件下开花时间与其野生型一致。我们试图构建rat1rat2双突变体,结果发现不能得到rat1/-rat2/-双纯合的突变体。亚历山大染色结果发现半杂合的rat1/+ rat2/-突变体的花粉正常。但其果荚中约有23.7%的胚是败育的。胚经透明之后,在微分干涉相差显微镜下观察发现rat1/+ rat2/-突变体的中胚发育推迟,最终不能发育成正常的胚,说明RAT1和RAT2基因可能参与胚发育的调节。我们又构建了RAT1-RNAi载体,转化rat2单突变体。转基因植株r2r1i(rat2/RAT1-RNAi)在长日条件下表现出晚开花表型。实时定量PCR研究结果表明,转基因植株r2r1i晚开花表型可能与开花基因FT的下调和FLC的上调有关。转基因植株r2r1i对光敏感,其下胚轴在不同的光下均比野生型变短,说明RAT1和RAT2基因可能以功能冗余的方式参与光形态建成。将RAT2与YFP融合转化拟南芥原生质体。共聚焦激光扫描显微镜结果表明RAT2-YFP定位于线粒体,说明RAT2也有可能在线粒体中起作用。cry1cry2双突变体在长日条件下比野生型晚开花。采用激活标签的方法,在cry1cry2双突变体背景下筛选到一个晚开花突变体ecc2 (enhencer of cry1cry2)。TAIL-PCR结果表明,ecc2突变体的T-DNA插入在第二条染色体上At2g45430开放阅读框附近。ecc2突变体晚开花的表型很可能是由于AHL22 (At2g45430)基因的过量表达引起的。凝胶电泳迁移率实验(EMSA)结果表明AHL22可以结合到富含AT碱基的DNA序列上,说明AHL22是一个AT-hook蛋白。采用荧光显微镜观察GFP-AHL22的亚细胞定位发现AHL22定位于细胞核。将野生型植株与GFP-AHL22转基因植株的细胞核纯化出来之后,采用免疫印迹(Western blot)的方法检测发现AHL22在细胞核中表达。进一步研究发现GFP-AHL22蛋白不受不同光的调节。我们的研究还发现AHL22蛋白丰度在根中较高,说明AHL22有可能在根中起作用。采用根特异性的启动子TobRB7驱动GFP-AHL22在根中表达,结果表明TobRB7:GFP-AHL22转基因植株开花时间比野生型略晚。共聚焦激光扫描显微镜结果表明只在TobRB7:GFP-AHL22转基因植株的根中观察到GFP荧光。此外,还筛选到另一个早花激活标签突变体,scc17-D (suppressor of cry1cry2#17-Dominant)。TAIL-PCR结果表明,scc17-D突变体的T-DNA插入在第一条染色体上的At1g25440和At1g25450两个基因之间。scc17-D突变体表现出植株矮化、叶片变小、果荚变小和子叶表皮细胞形状发生改变等性状。结果表明,scc17-D突变体对植物的发育具有广泛的调节功能。本研究为拟南芥隐花色素的功能研究提供了一个新的突变体。