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本研究以文心兰杂种‘小樱桃’文心兰(Oncidium Kutoo ’Little Cherry’,Onc. ornithorynchum×Tolu. variegata)试管苗为材料,进行乙烯代谢相关基因克隆与表达及ACO功能验证研究。采用RT-PCR结合RACE技术,克隆到了ACC合成酶基因ACS3和ACS7的部分序列,乙烯受体基因ERS两个成员ERS1、ERS2,铜离子转运基因CTR/COPT6和COBRA的全长序列；克隆了COBRA的gDNA序列；进行了这些基因在文心兰不同生长时期的qPCR分析；采用酶切连接法构建ERS-GFP融合蛋白植物表达载体,通过洋葱内表皮单层细胞荧光显色反应,研究了ERS基因的亚细胞定位。此外,通过酶切连接法构建ACO正义反义植物表达载体,并转化烟草,进行了文心兰ACO的基因功能的初步验证。主要研究结果如下：1.文心兰ACS3和ACS7基因的克隆及qPCR分析本试验克隆了文心兰ACC合成酶基因ACS3和ACS7的部分序列,其中ACS3已获得的序列为1516bp,登录号为：KF420438.1; ACS7已获得的已知序列为1344bp,登录号为：KJ650200。荧光定量PCR分析表明ACS3和ACS7的在文心兰不同生长阶段的表达情况并不相同,ACS3在文心兰成苗期表达量最高,幼苗时期表达量最低,ACS7同样在幼苗时期表达量最低,但是却在原球茎时期表达量最高。2.文心兰ERS的克隆、qPCR分析及亚细胞定位的研究本试验克隆了乙烯受体基因ERS两个成员,ERSI全长序列为2327b,登录号为：KJ155786;ERS2全长序列为2296bp,登录号为：KJ155787,两成员均含有一个1896bp的开放阅读框,两者的核苷酸相似性为97.5%,都编码631个氨基酸,其中有18个氨基酸不同,都是疏水的不稳定的中性蛋白,均不具有信号肽,亚细胞定位预测,最大可能在细胞膜中,并且通过洋葱内表皮侵染实验验证了这一预测。ERS的两个成员都具有7个保守结构域,3个跨膜螺旋,18个磷酸位点。qPCR分析发现,ERS基因在原球茎时期表达量最高,在幼苗期表达量最低,类似ACS7。3.文心兰COPT6的克隆及qPCR分析克隆获得的文心兰铜离子转运基因CTR/COPT6的全长序列788bp,登录号为：KJ650199,含有一个长度为465bp的开放阅读框,编码154个氨基酸.生物信息学分析表明：COPT蛋白是疏水的稳定性蛋白,不具有信号肽,最大可能定位于细胞膜,具有两个跨膜结构,只有两个磷酸位点,有两个结构域,没有卷曲螺旋。三级结构发现COPT蛋白主要由α-螺旋构成。荧光定量PCR分析表明COPT基因在幼苗期表达量最高,在成苗期表达量最低。4.文心兰COBRA基因的克隆及qPCR分析以文心兰试管苗为材料,采用RT-PCR结合RACE法,分离了文心兰COBRA基因cDNA全长和DNA序列,COBRA全长1601bp(GenBank检索号为：KF739400.1),开放阅读框(ORF)1386bp,编码461个氨基酸；COBRA的DNA序列共2949bp (GenBank检索号为：KF861576),有6个外显子,5个内含子。长度分别为115bp、80bp、457bp、160bp、281bp、293bp。qPCR结果表明,CORBA在成苗期表达量最高,在文心兰原球茎时期表达量最低。5.文心兰ACO基因转化烟草与功能的初步验证本试验采用酶切连接法将ACO基因的正义和反义片段构建到植物表达载体pCAM-BIA1301上,并将分别将正义／反义表达载体转化到农杆菌EHA105的感受态细胞中,进行烟草叶片的遗传转化,对转基因植株的进行PCR检测,同时进行GUS检测,检测目的基因的转化结果。试验结果表明：成功构建了ACO基因的正义和反义植物表达载体,获得正义转化的烟草28株,反义转化的烟草33株。通过PCR检测及GUS染色检测,大部分植株为转基因阳性植株,正义转化率为53.5%,反义转化率为67.2%。同时进行了乙烯利的处理,发现文心兰ACO对于抑制烟草ACO的表达具有一定的作用。