论文部分内容阅读
第一部分 自噬联合mTOR通路双重抑制对肾癌细胞的作用及其机制目的：探索肾癌细胞自噬水平以及mTOR活性,研究双重抑制对肾癌细胞生长的作用以及相关机制。方法：RCC4、ACHN、860、769P人肾癌细胞株及HK2人正常肾小管上皮细胞株均购自美国ATCC细胞库。利用Western blotting检测肾癌细胞以及正常对照细胞的基本自噬水平以及mTOR信号通路蛋白表达的变化。对比单独应用mTOR或自噬抑制剂,以及联合抑制三种治疗对肾癌细胞内mTOR及自噬通路的影响。同时,通过结晶紫试验研究mTOR及自噬的双重抑制对肾癌细胞增殖的影响,并通过研究细胞凋亡相关基因的表达,探讨自噬及mTOR双重抑制对肾癌细胞凋亡的影响。结果：相对于正常肾小管上皮HK2细胞,mTOR活性在4种肾癌细胞中均明显升高,786O、769P细胞基础自噬水平较HK2轻度升高,而RCC4、ACHN细胞不仅基础自噬水平较正常对照升高明显,其mTOR通路亦过度激活,对此类肾癌细胞进行mTOR抑制后,自噬水平进一步升高并不明显。这提示这些肾癌细胞中的自噬过程可能己不完全依赖mTOR调控。雷帕霉素在体外可以明显抑制7860和RCC4细胞的增殖,而使用shRNA、氯喹等方法抑制自噬仅对7860细胞增殖起协同抑制作用。通过mTOR和自噬的双重抑制引起了7860肾癌细胞凋亡,但并未引起RCC4细胞凋亡,其可能在RCC4细胞中引起坏死性凋亡(Necroptosis)。结论：肾癌细胞中均存在不同程度的mTOR活性增高和自噬水平增高,部分肾癌细胞同时具有高基础自噬水平和mTOR过度激活的特点。单独应用自噬或mTOR抑制剂对肾癌细胞株具有不同程度的抑制作用,而联合应用双重阻滞对具有高]mTOR、高自噬水平肾癌细胞(RCC4)的抑制效果明显低于自噬水平较低的肾癌细胞(7860)。双重抑制引起7860细胞凋亡,而可能引起RCC4细胞产生坏死性凋亡。第二部分 自噬联合磷酸戊糖途径双重抑制对肾癌细胞的作用及其机制目的：探索以RCC4为代表的具有高mTOR、高自噬水平肾癌细胞在抑制自噬后代谢通路的变化,并研究针对该代谢通路以及自噬双重抑制后对此类肾癌细胞的治疗作用。方法：为探索RCC4肾癌细胞在自噬抑制剂作用下代谢通路的改变,我们对氯喹和对照剂(DMSO)处理后的RCC4细胞进行了代谢谱分析。通过对结果进行代谢组富集分析(Metabolite Set Enrichment Analysis, MSEA),拟发现治疗组与对照组见差异最大的代谢通路改变,并通过给予RCC4细胞相应的抑制剂后检测细胞,研究氯喹与糖代谢抑制剂是否对RCC4细胞增殖具有协同抑制作用。因肿瘤中自噬及代谢通路的改变与氧化应激关系密切,我们通过检测细胞的氧消耗和营养物消耗评价RCC4细胞在自噬被抑制后代谢的改变。同时,通过对pNFxB的分析进一步了解自噬与代谢双重抑制对RCC4细胞产生抑制的可能机制。结果：RCC4肾癌细胞在应用氯喹前后代谢通路具有明显变化,其中磷酸戊糖途径(PPP)的变化最为明显。PPP途径活性在RCC4细胞自噬被抑制后明显升高,而其代谢产物的含量也显著增多。应用PPP途径抑制剂6-氨基烟酰胺(6AN)后,RCC4细胞的增殖受抑制,而氯喹显著增加了RCC4细胞对6AN治疗的敏感性。氯喹与6AN对RCC4细胞具有协同性抑制作用。RCC4细胞的自噬被抑制后,其对葡萄糖的摄取明显增多,而乳酸升高不明显,提示糖酵解并不是其糖代谢改变的主要途径,同时,PPP途径代谢产物在氯喹实验组显著更高。通过对pNF(?)B的分析,我们发现氯喹和6AN均使RCC4细胞中pNF(?)B增加,可能通过炎性体(Inflammasome)途径抑制RCC4细胞增殖。结论：RCC4肾癌细胞具有高mTOR、高自噬水平的特点,其对氯喹联合雷帕霉素治疗敏感性较低。通过对氯喹处理前后RCC4细胞的代谢谱分析发现,PPP途径增高可能是其产生抵抗的机制。联合应用氯喹和PPP抑制剂6-AN可对RCC4细胞产生协同抑制作用,同时,氯喹和6 AN均使细胞内NFxB水平增高,提示氯喹联合6AN对RCC4细胞增殖的抑制作用可能通过炎性体介导。第三部分 肾透明细胞癌中自噬、PPP途径相关基因表达和疾病预后的关系目的：探索肾透明细胞癌中自噬通路及磷酸戊糖途径(PPP)途径中重要基因的表达情况、与VEGF的关系以及与患者预后的关系。方法：我们采用in silico方法通过生物信息学手段提取并分析The Cancer Genome Atlas (TCGA)肾透明细胞癌数据库中所有完成了RNA-seq深度测序的基因表达数据。利用源自Memorial Sloan-Kettering癌症中心(MSKCC)开发的cBioPortal for Cancer Genomics在线TCGA分析软件进行分析。首先我们选取了肾透明细胞癌Provisional数据库中完成了RNA-seq深度测序的病例,随后我们选取了自噬通路中关键的8个基因(ULK1、ATG5、BECN1、ATG7、ATG12、 ATG13、MAP1LC3B、MAP1LC3C),以及PPP途径中关键的7个基因(G6PD、 PGLS、PGD、RPIA、RPE、TALDO1、 TKT),利用cBioPortal软件分析这些基因的表达在肾癌组织和癌旁正常肾组织中是否存在显著差异、对表达存在差异的基因分析其与肾癌患者预后的关系、交互分析自噬和PPP途径关键基因之间的相互关系。结果：我们采用cBioPortal分析平台分析了TCGA数据库中完成RNA-seq的469名肾透明细胞癌患者的临床病理资料。自噬相关基因ULK1、ATG7、MAP1LC3C表达改变的患者预后显著差于对照,而ATG5、BECN1、ATG12、ATG13、 MAP1LC3B表达与预后无显著相关性。包含上述基因的自噬相关基因集合的表达改变与患者预后显著相关。PPP相关基因G6PD、PGLS、GD、RPIA、TALDO1、TKT的表达改变的患者预后显著差于对照,而RPE表达与预后无显著相关性。包含上述基因的PPP相关基因集合的表达改变与患者预后显著相关。自噬与PPP相关基因间存在广泛联系。结论：自噬与PPP通路相关基因的表达改变与肾透明细胞癌患者的预后关系密切。自噬与PPP通路相关基因之间表达存在广泛的联系和相关性,提示自噬和PPP途径在肾透明细胞癌中可能起重要作用。