草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型的优秀除草剂。但因其对农作物同样具有杀死作用,而限制了使用范围和使用时间。随着抗草甘膦转基因作物在全球范围内的大面积种植,草甘膦的应用也随之越来越广泛。2004年全球转基因作物面积为8100万亩,而抗草甘膦作物的种植一直居优势地位。 目前报道的抗草甘膦转基因作物中,驱动抗性基因表达的都是强表达的组成型启动子,使这些抗草甘膦基因几乎在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都高效表达,这无疑增加了植株的代谢负担,造成物质和能源上的巨大浪费。为了使外源抗草甘膦基因在转基因植物体内发挥作用的同时尽可能减少对受体植物的不利影响,本研究的主要目的是分离草甘膦胁迫诱导高表达基因及启动子,以期为进一步利用该启动子驱动外源抗草甘膦基因或其它功能基因只在草甘膦喷施后高效表达奠定基础。 本研究通过DDRT-PCR技术,筛选40对引物组合,从棉花和大豆中共获得65个诱导前后表达量有明显差异的EST序列。其中从大豆中获得正调控片段31个,负调控片段8个;从棉花中获得正调控片段25个,负调控片段1个。BLAST结果表明:草甘膦诱导的EST序列与水杨酸诱导、茉莉酸激发、NaCl处理、冷胁迫、热激、病原体处理等其它非生物胁迫诱导的序列有高达82%以上的同源性。进一步通过RT-PCR筛选出草甘膦诱导后在棉花中表达量最显著增加的序列ag2。并通过Northern blot确证该片段为草甘膦诱导后高表达的基因。 然后,利用RACE技术分离获得763bp的ag2基因全长cDNA序列,并扩增得到856bp相应基因组序列。结果表明该基因包含2个外显子和1个内含子,编码区全长456bp,编码152个氨基酸残基。并推断ag2是一个抗逆相关基因。由于其功能还未见报道,说明该基因是一个功能未知的新基因。为验证ag2因的功能,分别构建了其正义(pBIag2A)和反义(pBIag2S)植物表达载体,用花粉管通道法导入棉花品种Y18中,共收获种子1.73Kg。经卡那霉素初筛、PCR复测获得转pBIag2S阳性植株33株,转pBIag2A阳性植株18株。同时将ag2正义(pBIag2A)植物表达载体转化烟草,获得PCR阳性植株29株。分别对转基因烟草植株进行水杨酸及接枯萎病菌处理,对T1代棉花种子进行耐涝和耐盐试验,结果表明:转ag2基因的植株对水杨酸、枯萎病菌及NaCl均表现出一定的抗性,说明ag2基因产物可能是诱导反应过程中的一个信号传递成员,也可能是诱导反应的终产物,总之,ag2的高表达产物参与了植物的抗逆反应过程。 利用hemispecific PCR和Cassette ligation PCR,经过3次步移,从预测的ag2转录起始位点向5′方向延伸得到长度为2063bp的启动子序列。目前,该启动子序列在GenBank中还没有注册信息。为验证其功能,根据ag2启动子的结构特征和表达调控元件的分布,设计了4个启动子片段缺失突变体,并分别与GFP融合,构建了4个植物表达载体pBIP1GFP、pBIP2GFP、pBIP3GFP和pBIP4GFP,转化烟草NC89,目前获得17株pBIP1GFP和23株pBIP2GFP PCR阳性植株。对pBIP2GFP转基因植株的GFP荧光强度检测结果表明:ag2启动子P2片段具有明显的诱导特性,草甘膦处理后14h,GFP荧光信号增强17倍。 同时用agroinfiltration将pBIP1GFP、pBIP2GFP、pBIP3GFP和pBIP4GFP植物表达载体注射入非转基因烟草活体叶片的两个叶脉之间。3天后取样检测发现:4种启动子片段本底表达水