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1.背景与目的:骆驼蓬（Peganum harmala Linn）是一种多年生草本植物,在中国、中东和南亚等地区被广泛用于治疗癫痫、偏瘫、健忘、神经痛、高血压、哮喘、皮下肿瘤、瘙痒和多种慢性疼痛。在以往的研究中,从骆驼蓬植物中发现了两类生物碱（β-咔波啉生物碱和喹唑啉类生物碱）,β-咔波啉生物碱因其对单胺氧化酶（MAO）、乙酰胆碱酯酶（ACh E）和丁酰胆碱酯酶（BCh E）的强可逆性抑制作用,能够显著地改善学习记忆,在治疗精神疾病和神经退行性疾病方面具有较好的潜力。但是随后研究发现β-咔波啉生物碱具有潜在的中枢神经系统毒性,并引起震颤、幻觉等副作用。十分值得关注的是另一类喹唑啉类生物碱并没有相关副作用,其中脱氧鸭嘴花碱（Deoxyvasicine,DVAS）是骆驼蓬植物中活性喹唑啉生物碱的主要代表性成分之一,现代研究发现其具有抗菌、止咳平喘、杀虫等药理作用。课题组前期研究发现DVAS也是一种较强的胆碱酯酶抑制剂,其体外抗丁酰胆碱酯酶抑制活性比骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱及鸭嘴花碱（Vasicine,VAS）强,是一种潜在的具有抗老年痴呆作用的化合物。但是,关于DVAS抗老年痴呆药效作用及其体内外代谢、药物动力学并没有报道,因此,本文采用中药药理学、中药代谢动力学、分析化学等原理和技术,对DVAS开展药效、药代动力学等研究,以期阐明DVAS改善学习记忆作用机制及其体内过程,为其新药研发提供参考。2.方法（1）DVAS改善学习记忆作用机制研究:利用东莨菪碱腹腔注射C57BL/6小鼠,得到获得性记忆障碍模型,采用Morris水迷宫实验,考察DVAS对记忆损伤模型小鼠行为学的影响。动物分为6组:空白对照组、模型组、阳性对照组（石杉碱甲,0.2 mg/kg）、DVAS低（5 mg/kg）、DVAS中（15 mg/kg）、DVAS高（45 mg/kg）剂量组。在连续给予相应药物7天后,除空白组外（注射生理盐水）,剩余5组在第8天开始每天固定于灌胃给药30 min后,腹腔注射1 mg/kg东莨菪碱,持续7天,于第15天进行水迷宫空间搜索实验,次日于腹腔注射东莨菪碱30 min后进行动物大处理,取小鼠海马、皮层组织。之后,通过酶联免疫吸附实验、组织病理切片、蛋白质印迹法等药理学技术对相关酶活性、炎症因子、氧化应激因子及蛋白表达进行初步研究。此外,利用课题组前期神经递质定量分析方法,对C57BL/6小鼠的脑组织中神经递质的含量进行检测,初步探讨DVAS对脑内重要神经递质的影响。（2）脱氧鸭嘴花碱体内外代谢研究:对DVAS在大鼠肝微粒体体外Ⅰ、Ⅱ相共孵育体系中,并以大鼠口服40 mg/kg DVAS后,收集血浆、胆汁、尿液及粪便样品,利用UPLC-QTOF-MS/MS对代谢产物进行初步结构鉴定,对DVAS体内外代谢轮廓和代谢特征进行考察。（3）脱氧鸭嘴花碱及代谢产物在大鼠体内的药物动力学研究:建立和验证大鼠血浆中DVAS及其代谢产物含量测定的UPLC-MS/MS方法,对静脉和口服给予DVAS后,大鼠血浆中DVAS及其代谢产物的药物动力学进行研究,获得口服给药后的绝对生物利用度及其他主要药动学参数,并对入血原型和代谢产物的胆碱酯酶抑制作用进行相关性分析,探讨其体内主要胆碱酯酶抑制活性成分。3.结果:（1）脱氧鸭嘴花碱改善学习记忆作用机制研究:以东莨菪碱诱导学习记忆损伤造模,结合Morris水迷宫小鼠行为学评价实验显示,DVAS对东莨菪碱所致记忆获得性障碍具有明显的改善作用。研究结果显示,连续7天腹腔注射东莨菪碱（1mg/kg）后,在定位航行训练的第4-5天,模型组小鼠的游泳路程与上台潜伏期较对照组明显的增加,均表现出显著的统计学差异（P<0.01）。在腹腔注射东莨菪碱的同时,给予小鼠DVAS低、中、高剂量的三组动物中,小鼠的游泳路程和上台潜伏期会随着定位航行训练天数的增加而逐渐减少,且在定位航行训练的第4-5天,与模型组相比均显著降低（P<0.05,P<0.01或P<0.01）。在空间探索实验中,模型组小鼠的上台次数较对照组明显降低（P<0.01）。而DVAS低、中、高剂量组的穿台次数较模型组,均有显著的增加（P<0.05,P<0.01或P<0.001）。综合上述实验结果,DVAS对东莨菪碱诱导的记忆损伤模型小鼠的空间记忆能力表现出显著的改善作用,且具有一定的剂量依赖性。与对照组相比,东莨菪碱能使小鼠皮层和海马中ACh E的活性均有显著的增加（P<0.01或P<0.001）,而Ch AT和BDNF的活性明显降低（P<0.01）。给予DVAS后,皮层和海马中ACh E的活性均有显著的降低（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,而且海马中Ch AT、BDNF的活性均有明显增加（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,且高剂量组的增加作用最为显著;而45 mg/kg剂量组的皮层中Ch AT、BDNF的活性均有明显增加（P<0.05）。其次,与对照组相比,模型组小鼠皮层中TNF-α的活性和NO的生成量均有显著的增加（P<0.01）,给予DVAS 5、15、45mg/kg后,小鼠脑皮层中TNF-α的活性均有显著的降低（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,而DVAS低中剂量组小鼠脑皮层中NO均有显著降低（P<0.01或P<0.05）。此外,与对照组相比,模型组小鼠皮层中SOD、GSH-px的活性明显下降（P<0.01）。当给予DVAS后,小鼠脑皮层中GSH-px的活性显著增加,与模型组相比具有显著的统计学差异（P<0.05,P<0.01或P<0.001）;但是DVAS对小鼠皮层中SOD的含量与模型组相比无统计学差异。与对照组相比,模型组小鼠皮层中ACh、5-HT、γ-GABA含量均有显著降低（P<0.05或P<0.01）,而5-HIAA和Glu的含量均显著升高（P<0.05或P<0.01）,但是对Ch、L-Asp和L-Trp的含量几乎没有影响（P>0.05）。当给予DVAS后,小鼠皮层中的γ-GABA水平均有显著升高（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,另外除了DVAS低剂量组,其他剂量组的ACh和5-HT水平明显升高（P<0.05,P<0.01或P<0.001）;另外,DVAS各剂量组小鼠皮层中5-HIAA含量均有显著降低（P<0.05,P<0.01或P<0.001）,而除了DVAS低剂量组,其他剂量组皮质中Glu水平均有显著降低（P<0.01或P<0.001）,并且以上DVAS对神经递质的调节作用,均表现出一定剂量依赖性。（2）脱氧鸭嘴花碱体内外代谢研究:在DVAS体内外代谢研究中,共鉴定了23种代谢产物,以尿液和胆汁最多,分别发现了23和22种代谢产物,在大鼠肝微粒体中发现6种,在粪便中发现13种,在血浆中发现8种,粪便中发现13种代谢产物。结果表明DVAS大部分代谢产物主要通过尿液和胆汁排泄,另外I相代谢以羟基化、羰基化为主,II相代谢以乙酰化、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化为主。（3）脱氧鸭嘴花碱及代谢产物在大鼠体内的药物动力学研究:在代谢产物鉴定的基础上,完成了对大鼠血浆中DVAS及其4种代谢产物的全定量及其他4种代谢产物相对定量的UPLC-MS/MS检测方法,并运用该方法对DVAS在大鼠体内口服及静脉的药代动力学进行研究,获得了DVAS口服生物利用度约为47.46%。灌胃5、15 mg/kg DVAS时,DVAO与原型的AUC比值分别为31.91%和30.66%;灌胃5、15 mg/kg DVAS时,VAO与原型的AUC比值分别为15.8%、16.40%;然而,灌胃45 mg/kg DVAS时,DVAO与原型、VAO与原型的AUC比值分别为22.17%和3.23%,显著低于其他剂量下的AUC比值,另外在45 mg/kg或者剂量更高时,大鼠体内对DVAS的代谢酶会达到饱和或者存在其他进一步的代谢过程。而体外实验发现血浆抗胆碱脂酶活性主要与DVAS有关,而与其他代谢产物相关性较低。4.结论:DVAS主要通过增强胆碱系统（抑制ACh E和增加Ch AT的酶活力和蛋白表达）,抗炎作用（抑制TNF-α的活力）、抗氧化应激作用（增加GSH-px的活力）、神经保护作用（增加BDNF和降低Glu的含量）、神经递质调节作用发挥改善学习记忆的作用,且表现出一定的剂量依赖性。DVAS体内外代谢产物较多,其中代谢途径为羟基化、羰基化、乙酰化、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化代谢为主,药物动力学研究发现DVAS具有较好口服生物利用度,且体内达峰和消除时间均较快(Tmax约0.46 h,T1/2ke约1.47 h),另外主要I相代谢产物DVAO及VAO血药浓度均很高,AUC均达到DVAS的15%以上,因此有必要对其开展进一步药效动力学研究;在45 mg/kg剂量下的DVAO及VAO血浆含量占比明显下降,提示大鼠体内对DVAS的代谢酶可能达到饱和或者存在其他进一步代谢的过程。在胆碱酯酶抑制活性方面,其体内活性主要与原型DVAS有关,DVAS的代谢过程主要是一种降活或灭活的过程。