【摘 要】
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目的:本课题研究通过体外细胞实验明确过表达与沉默hsa-miR-21-5p在hPDLSCs成骨分化早期所发挥的作用机制,预测并验证hsa-miR-21-5p的新靶标,探讨hsa-miR-21-5p、LRP6与hPDLSCs成骨分化的相互关系,为未来正畸中牙周组织改建和骨再生的研究提供一定的理论依据与新思路。方法:1、收集12～20岁正畸患者健康的前磨牙,采用组织块培养法体外培养原代hPDLSCs,
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目的:本课题研究通过体外细胞实验明确过表达与沉默hsa-miR-21-5p在hPDLSCs成骨分化早期所发挥的作用机制,预测并验证hsa-miR-21-5p的新靶标,探讨hsa-miR-21-5p、LRP6与hPDLSCs成骨分化的相互关系,为未来正畸中牙周组织改建和骨再生的研究提供一定的理论依据与新思路。方法:1、收集12～20岁正畸患者健康的前磨牙,采用组织块培养法体外培养原代hPDLSCs,通过有限稀释法筛选提纯,CCK8法检测细胞增殖能力并绘制生长曲线,再通过形态学观察、流式细胞术细胞表面分子标记物鉴定、细胞周期分析、免疫荧光染色、成骨成脂诱导多向分化实验等方法鉴定细胞。2、分别对成骨诱导了不同时间点:0d、3d、5d、7d、14d、21d的hPDLSCs进行qRT-PCR和Western Blot实验检测,比较hsa-miR-21-5p与成骨相关因子ALP、RUNX2的相对表达量的变化。3、构建过表达与沉默hsa-miR-21-5p慢病毒载体,通过设置不同MOI选出转染hPDLSCs的最佳MOI值,之后设置实验分组:空白对照组（blank control）、过表达miR-21-5p慢病毒组（miR-21-5p mimic）、过表达miR-21-5p阴性对照慢病毒组（mimic NC）、沉默miR-21-5p慢病毒组（miR-21-5p inhibitor）和沉默miR-21-5p阴性对照慢病毒组（inhibitor NC）。诱导细胞成骨分化后检测各组hsa-miR-21-5p含量的变化,同时采用qRT-PCR和Western Blot实验检测成骨相关因子ALP、RUNX2的mRNA与蛋白相对表达水平,观察hsa-miR-21-5p对hPDLSCs成骨分化能力的影响。4、利用多种数据库在线预测miR-21-5p的靶标,结合以往文献和前期实验研究进行分析筛选出LRP6,通过qRT-PCR和Western Blot实验分别检测miR-21-5p mimic、mimic NC、miR-21-5p inhibitor和inhibitor NC组的hPDLSCs在成骨分化过程中LRP6的mRNA和蛋白相对表达水平,并检测未转染病毒的hPDLSCs成骨诱导分化中LRP6的表达量变化,研究miR-21-5p与LRP6的相互关系。构建miR-21-5p、LRP6野生型（WT）及突变型（MUT）载体质粒,采用双荧光素酶报告基因检测技术验证两者的结合位点。结果:1、本实验所培养的hPDLSCs呈梭形、放射状生长,经传代分离提纯后生长状态稳定,生长曲线呈“S”形,流式细胞术及免疫荧光染色结果表明本实验所培养的hPDLSCs来源于间充质;细胞周期结果符合干细胞的慢周期性;成骨诱导后有大量矿化结节产生,成脂诱导后形成大量橘红色脂滴。2、相对于未诱导的0d组,其余时间组的ALP、RUNX2和miR-21-5p的表达量均上升,差异有统计学意义（P0.05）。3、慢病毒转染hPDLSCs的最佳MOI值为80,与对照组相比,miR-21-5p mimic组的ALP、RUNX2表达水平均上升,miR-21-5p inhibitor组的ALP、RUNX2表达水平均下降,差异均有统计学意义（P<0.001）。4、miR-21-5p mimic组中LRP6的表达水平上升,miR-21-5p inhibitor组中LRP6的表达水平下降,与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.001）。双荧光素酶报告基因结果验证了hsa-miR-21-5p可与LRP6在3’-UTR上的预测靶位点相结合。结论:1、本实验成功分离培养并提纯hPDLSCs,并证实其符合间充质干细胞的特性,具有多向分化潜能。2、本实验成功转染过表达及沉默miR-21-5p慢病毒,从基因与蛋白水平上证实了miR-21-5p对hPDLSCs的体外成骨分化具有正向调控作用。3、miRNA-21-5p通过作用于LRP6正向调控hPDLSCs的体外成骨分化,LRP6为miR-21-5p的靶标。
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