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近年来,随着糖皮质激素和化疗药物的广泛应用,实体器官移植、造血干细胞移植等的广泛开展,侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的发病率显著上升,且死亡率极高。早期诊断对IA的成功治疗至关重要,但是目前的IA诊断方法存在检测周期长、敏感性低等缺点,不能满足临床需要。国内外学者正努力寻找用于IA早期诊断的生物标志物。课题组前期筛选了一批免疫优势抗原,首次发现果胶裂解酶A (pectate lyase A, PlyA)与IA患者血清存在免疫反应,有望作为IA的诊断标志物。研究目的原核表达烟曲霉PlyA蛋白,建立检测人血清中抗PlyA蛋白IgG类抗体的间接ELISA方法,评估其在IA诊断中的潜在价值。研究方法对烟曲霉PlyA的基因序列进行生物信息学分析,选择大肠埃希菌偏爱的密码子,进行基因序列优化。委托生物公司合成编码PlyA的DNA序列,并连接到pET28a表达载体,构建重组表达质粒。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3), IPTG诱导表达PlyA重组蛋白；Western blot分析重组蛋白质与抗His标签蛋白(His-tag)单克隆抗体和侵袭性曲霉病患者血清中相应抗体的反应性。用重组PlyA包被微孔板,建立检测抗PlyA抗体的间接ELISA方法,检测IA病人血清,评估该方法对IA的诊断价值。分析了联合检测抗烟曲霉PlyA、TR和DPPV抗体的诊断效果。研究结果(1)同源性分析显示烟曲霉PlyA与人蛋白质不存在同源性,与其他常见病原菌蛋白质的同源性较低。PlyA基因的密码子优化后,在保持氨基酸序列不变的条件下,DNA序列中有18.84%的核苷酸改变。合成基因并成功构建了重组PlyA表达载体,并诱导表达获得带有His标签的PlyA蛋白。(2) Western blot结果表明烟曲霉PlyA可与抗His标签抗体、IA患者血清发生特异性反应,但与其他侵袭性真菌感染病人(如侵袭性念珠菌病)血清和健康人血清无反应。(3)建立了检测抗烟曲霉PlyA抗体的ELISA方法,批内变异系数(CV)为5.3%,批间CV为10.9%,阻断试验阻断率>90%,显示该方法具有良好稳定性和特异性。(4)以该方法检测IA患者血清,选择临界值为0.533时,该方法对IA诊断的敏感性51.5%,特异性94.3%。在非中性粒细胞缺乏的IA患者抗PlyA抗体阳性率高于中性粒细胞缺乏的IA患者。抗PlyA、抗TR和抗DPPV抗体联合检测的阳性率可提高到88.7%。结论本研究成功制备了烟曲霉PlyA的重组蛋白,建立了检测抗PlyA抗体的ELISA法,并证明该方法对IA的早期诊断具有潜在的应用价值。