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目的本实验室前期研究发现miR-146b能引起卵巢癌细胞骨架排列紊乱,抑制卵巢癌侵袭转移。在此基础上,本课题以miR-146b的靶基因为切入点,从肌动蛋白骨架和细胞间连接角度解析miR-146b引起卵巢上皮细胞癌（epithelial ovarian cancer,EOC）细胞形态改变,进而抑制细胞迁移和侵袭的机制。方法1.利用生物信息学方法预测miR-146b的靶基因,将其中评分较高且与维持细胞形态密切相关的Ras相关的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1）作为候选靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验验证其与miR-146b的靶向关系。2.免疫印迹检测瞬时或稳定过表达miR-146b对Rac1蛋白表达水平的影响。3.构建两个pLKO.1-puro Rac1 shRNA慢病毒载体,分别包装后感染卵巢癌细胞,免疫印迹验证Rac1敲减水平。4.倒置显微镜观察稳定敲减Rac1的卵巢癌细胞形态,免疫印迹检测细胞肌动蛋白和紧密连接蛋白1（zonula occludens-1,ZO-1）的表达水平,免疫荧光染色后采用共聚焦荧光显微镜观察F-肌动蛋白（F-actin）和ZO-1分布。细胞划痕和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。5.构建pCDH-NEO miR-146b sponge慢病毒载体,包装后感染稳定过表达miR-146b的OVCAR3细胞,筛选后获得逆转miR-146b的OVCAR3细胞,实时荧光定量PCR检测miR-146b抑制水平。免疫印迹、倒置显微镜、免疫荧光染色、细胞划痕和Transwell侵袭实验分别检测细胞Rac1水平、细胞形态、骨架、迁移和侵袭能力的恢复。6.构建pCDH-NEO Rac1 CDS慢病毒载体,包装后感染OVCAR3-miR-146b细胞,筛选后获得挽救Rac1的OVCAR3细胞。免疫印迹检测Rac1水平,倒置显微镜、免疫荧光染色、细胞划痕和Transwell侵袭实验观察挽救Rac1表达能否恢复细胞的形态、骨架、迁移和侵袭能力,进一步验证miR-146b抑制Rac1的生物学作用。结果1.双荧光素酶报告基因实验发现,与对照组相比,共转pri-miR-146b和Rac13’-非编码区（3’-untranslated region,3’-UTR）明显抑制荧光素酶活性（P<0.05）,而将Rac1 3’-UTR中miR-146b的种子序列突变后,荧光素酶活性又得到恢复（P>0.05）。2.免疫印迹结果表明瞬时或稳定过表达miR-146b后,卵巢癌细胞中Rac1蛋白表达下降。3.免疫印迹结果证实Rac1 shRNA1能明显敲减卵巢癌细胞中Rac1的蛋白表达水平,而Rac1 shRNA2并不能敲减Rac1的表达。4.稳定敲减Rac1的卵巢癌细胞的表现与过表达miR-146b的细胞类似,形态明显缩小,且呈现典型上皮样;尽管F-actin和ZO-1表达量无明显改变,但F-actin结构被破坏,排列紊乱无序;ZO-1由分散胞浆分布转变为集中于细胞间分布;细胞划痕和Transwell实验发现,敲减Rac1的细胞迁移和侵袭能力较对照组显著下降（P<0.01）。5.成功构建pCDH-NEO miR-146b sponge载体,虽实时荧光定量PCR无法证实miR-146b表达下降,但Rac1表达恢复,且卵巢癌细胞形态呈纺锤形间质样、F-actin骨架排列整齐有序、细胞迁移和侵袭能力增强。6.成功构建pCDH-NEO Rac1 CDS载体,免疫印迹结果表明Rac1表达被逆转,并部分挽救了过表达miR-146b所引起的卵巢癌细胞形态、骨架、迁移和侵袭能力的变化。结论卵巢上皮细胞癌中miR-146b通过抑制靶基因Rac1,引起细胞骨架排列紊乱、细胞间连接加强,导致卵巢癌细胞形态缩小呈上皮样,从而导致细胞迁移和侵袭能力下降,为卵巢癌转移提供新的研究靶点。