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金属阳离子通过生物氧化从可溶矿物中浸出并伴随复合物产生的过程,叫做生物浸矿。嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)是一种分离于酸性矿水的专性化能自养微生物,属于γ-变形菌门,革兰氏染色呈阴性,具有较高的Zn/Cd抗性,是微生物浸矿中后期的优势菌株。在王鹏的硕士学位论文中,对A.caldusMTH04 Cd2+刺激下的基因转录水平进行转录组学分析,发现两个基因出现明显上调变化,即orf2634、orf2635。其中,orf2634上调4.21倍,orf2635上调2.95倍,并预测orf2634编码Cd抗性转录调节子CadC,orf2635编码Cd抗性相关透性酶。在先前的文献报道中,cadCA操纵子编码的两个蛋白共用一个启动子,cadC编码转录阻遏蛋白CadC,可以结合Zn2+/Pb2+/Cd2+;而cadA编码Cd外排ATPase。该操纵子授予金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cd抗性。虽然A.caadus MTH04中编码的这两个蛋白与cadCA操纵系统存在差异,但转录组学分析显示其参与Cd2+抗性调节。因此,本文对A.caldus中发现的CadC(rO2634)及其后的透性酶(orf2635)进行研究,探究其在A.caldus Zn/Cd抗性中的作用。首先,本文提取正常培养条件下A.caldus MTH-04的RNA,并反转录成cDNA,分析orf2634、orf2635间的转录调节。通过分析发现,orf2634、orf2635共用一个启动子,共同转录。为了进一步研究该操纵子在A.caldus Zn/Cd抗性中的作用,对该基因簇进行敲除,并测定突变株在Zn/Cd刺激下的生长曲线,显示该基因簇的敲除引起A.caldus Zn抗性的下降,可能引起A.caldus Cd抗性的提高。其次,为了研究透性酶orf2635的功能,进一步构建A.caadus(△orfy2635)单敲株及过表达株(pJRD215-Ptac-orf2635),测定其在Zn/Cd刺激下的生长曲线,显示orf2635的敲除引起A.caldus Zn抗性的上升,Cd抗性的下降。过表达orf2635引起A.caldus Zn/Cd抗性的降低。通过RT-PCR,测定A.caldus(△orf2635)在0.09M Zn2+刺激9天以及0.04M Cd2+刺激9天时,orf2634的表达情况,显示添加Zn、Cd刺激不能orf2634转录水平的变化。当添加Cd2+刺激时,引起编码磷酸盐转运蛋白的pstA基因上调,显示其可能参与A.caldus Cd2+抗性的调节。最后,为了研究orf2634的调节机制,对orf634表达的蛋白进行异源表达纯化,利用EMSA实验,探究orf2634与启动子DNA间的相互作用以及DNA-Protein复合物在金属离子作用下的解离情况。经实验证实,orf2634编码的蛋白可以与该基因簇的启动子DNA相结合,而Cd2+的添加会引起这种结合的解离。本文确定了A.caldus MTH-04中两个基因参与其Zn/Cd抗性调节,即orf2634、orf2635;且这两个基因处于同一个操纵子内,orf2634编码的转录调节蛋白可与该操纵子启动子区域结合,并且这种结合在添加Cd2+后解离。