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Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+ antiporters,NHAs,Na+/H+泵)可以利用初级质子泵产生的跨膜质子电化学梯度为动力,将膜内过量的Na+(Li+)等阳离子排除膜外,同时将H转运至膜内,从而维持胞内较低的Na+(Li+)浓度以及胞内pH稳态。作为重要的钠离子次级外排系统,NHAs在维持胞内正常的盐离子浓度、pH稳态、孢子形成萌发等生命活动中发挥重要作用。中度嗜盐嗜碱菌具有丰富的Na+外排系统,可耐受较宽的盐浓度且具有重要的应用价值。课题组前期从强碱性造纸黑液中分离得到一株中度嗜盐嗜碱菌Halomonassp.Y2。其基因组注释四种Na+/H+逆向转运蛋白基因,其中包括两种NhaD型Na+/H+逆向转运蛋白基因,nhaD1、nhaD2,其编码蛋白分别为NhaD1及NhaD。2NCBI BLAST比对结果显示NhaD1与NhaD2具有高达72%的序列一致性。此外,该两种NhaD型Na+/H+逆向转运蛋白与目前已研究报道的He-NhaD、Aa-NhaD、Vp-NhaD以及Vc-NhaD均具有较高的序列一致性(50%以上)。通过功能互补的方法,课题组前期成功在缺陷菌株E.coliKNabc中构建了 NhaD1和NhaD2的工程菌株。首先,本研究对NhaD1与NhaD2互补缺陷菌E/KNabc耐盐性及盐胁迫下耐碱性生长进行研究。据报道,缺陷菌E.coli KNabc因缺失3个主要的Na+外排基因(nhaA、nhaB和chaA),不能在LBK培养基(含200mMNaC1)环境中生长。结果发现:NhaD1对E.coliKNabc耐盐性互补能力较弱,其只能耐受200mMNaC1或100mMLiC1浓度,盐胁迫下耐碱性生长不明显。但是,NhaD2表现出较强的互补生长能力,其可使缺陷菌E.coliKNabc耐受高达500mMNaC1或400 mM LiC1环境,Na+(或Li+)胁迫下分别可耐受pH 8.0及pH 8.5碱性环境。反转膜活性结果发现,尽管两者在耐受性生长上有明显区别,但都表现出相似的Na+(Li+)/H+转运活性。同时,NhaD1、NhaD2具有相似的Na+、Li+底物亲和性(以Na+为适宜底物)以及Li+转运的pH依赖性(pH越高活性越高)。然而,两者在Na+转运过程中呈现不同的pH依赖性。两者在pH 6.5-9.5下均具有明显Na+活性,pH 6.0下NhaD2不表现出Na+活性而NhaD1 Na+活性达15%左右;此外,NhaD1转运Na+最适pH为8.0-8.5,而NhaD2在pH 9.5下达到最高活性。两者相比,NhaD1转运Na+的pH依赖性明显偏酸性;而NhaD2转运Na+的pH依赖性相对偏碱。进一步,为研究影响NhaD1及NhaD2互补生长及转运活性pH依赖性的关键位点,将其与另外6种已报道的NhaD型Na+/H+逆向转运蛋白进行多序列比对,通过重组PCR对NhaD1的11个位点进行定点突变。结果发现:V861,N166D,M168L,M172L,I236L,N247S和I346V突变体完全丧失在所有pH下Na+/H+及Li+/H+活性,说明这些位点对维持NhaD1的Na+/H+及Li+/H+活性是至关重要的,并且不可替代,可能直接或间接参与活性中心。A87G、S200A与S353A突变体活性有不同程度的明显降低,但pH依赖性与NhaD1—致,说明该三个位点对维持其活性发挥重要作用,但不影响其pH调控。S282A突变体活明显降低,与原始NhaD1相比,其Na+/H+活性pH依赖性发生偏移,其最适pH值比原始NhaD1碱性偏移1.5个pH单位。该位点位于Ⅷ跨膜区处,分析丝氨酸(Ser,S)可能与附近其它氨基酸共同对NhaD1 Na+/H+活性pH依赖性发挥重要作用。与原始NhaD1相比,S353A突变体Na+及Li+表观Km值均明显增加,提高幅度将近10倍,猜测S353位点很可能是影响NhaD1 Na+及Li+结合的关键位点。最后,在NhaD1、NhaD2氨基酸序列比对及预测跨膜结构的基础上,分别以NhaD1、NhaD2为模板,构建一系列D1及D2嵌合体蛋白,并对其转运活性进行测定。NhaD1与NhaD2两者在1-39氨基酸区域保守性极低,两者N端互相替换后转运活性完全丧失,说明两者N端各自有其特殊结构并发挥特有的作用,且不能互相替代。NhaD2C端(489SVYG492)对其维持生长互补及转运活性至关重要,且不可或缺。另外,NhaD2 C端(463-492)区域很可能是其pH调控的关键区域。C463rD2-C7嵌合体只能耐受300mMNaC1(OD600nm≈0.2),与原始NhaD2耐受性相差较大。说明NhaD1 463-485区域是影响菌株耐受性生长的关键区域。