细胞表面展示技术是指通过锚定蛋白与外源蛋白融合表达,借助锚定蛋白可结合到细胞外膜的特性将外源蛋白携带到细胞的表面,一方面克服了因为细胞膜的阻隔而造成底物和酶蛋白无法接触的困难,提高了底物与酶的反应效率,另一方面,细胞表面展示大大地简化了酶蛋白纯化和回收再利用的过程。因此,细胞表面展示广泛应用于构建蛋白质筛选文库、抗体疫苗开发、全细胞催化和环境修复。目前,细胞表面展示技术使用在多种宿主菌株中,其中,大肠杆菌是传统的基因工程菌,有非常成熟的基因操作手段,而且大肠杆菌自身的生长繁殖快,能大量表达外源蛋白,因此在细胞表面展示系统是有优势的。在过去的几十年间,大肠杆菌的细胞表面展示技术日益纯熟,并且已经发展了多种锚定蛋白,如OmpA,Blc,冰核蛋白(Icenucleationprotein,INP)系统等,其中,自主转运蛋白(Autotransporter,AT)被认为最具有潜力展示分子量大、结构复杂的外源蛋白,而我们所采用的Antigen 43(Ag43)就是自主转运蛋白的一种。Ag43是大肠杆菌K-12自身的一种自主转运蛋白,是一个较为新奇的细胞表面展示系统,目前,可以检索到的相关文献还较少。因此,关于Ag43的应用和发展还有很大的研究前景。本文的研究围绕Ag43细胞表面展示系统展开,目的在于表征Ag43能携带外源蛋白到细胞表面的能力,发现和挖掘Ag43展示系统更多的应用和发展潜力。我们选取了三种不同的目标外源蛋白,分别是来自海葵珊瑚的红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)、枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶(Endoglucanase,BsCel5)和博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase,CbFDH),采用不同的表达载体—pET28a和pBAD99a,以及Ag43的两个取代位点,我们将目的基因取代Ag43的53-137 aa或53-699 aa片段,简单标记为138和700两个位点,具体结果如下:一、不同外源蛋白、表达载体和取代位点产生不同的表达水平。细胞表面展示的CbFDH的表达水平低于其它两种蛋白。同时,不同的质粒载体的所控制的表达水平也不一样,对于pBAD99a,当目标蛋白取代Ag43的第53-137aa时(即138),其表达量更高;对于pET28a,当目标蛋白取代Ag43的第53-699aa时(即700),其表达量更高。二、细胞表面展示RFP能使菌体的颜色变化,尤其是在表达载体pET28a中,但是表面展示的RFP没有使菌体颜色变得更红,反而是胞内表达RFP的菌体颜色更深,我们猜测这是跟红色荧光蛋白的发光原理有关,当RFP被展示到胞外时,暴露在培养基中,RFP容易被外界的其它物质氧化或还原,致使荧光减弱。三、细胞表面展示BsCe15能保持活性,并且不需要打破细胞取得酶,使全细胞酶活大大提高,尤其是pET28a-Ag43-138-BsCel5的全细胞酶活最高,使我们对Ag43表面展示外源蛋白作为全细胞催化剂的发展有更好的展望。四、细胞表面展示CbFDH虽有重组蛋白的产生,但是却检测不到其活性,我们猜测这与CbFDH本身的特性有关,CbFDH活性低,结构复杂,而且细胞表面展示辅因子依赖型酶蛋白长期以来都是一个巨大的挑战。五、如何证明外源蛋白的确有展示到细胞表面,是我们在Ag43细胞表面展示研究中必须解决的问题,因此我们采用全细胞胰蛋白酶处理的方法,证明外源蛋白可借助Ag43展示到细胞表面,并且当目标蛋白取代的是Ag43的53-137aa(即138)时,将有更多的外源蛋白展示到细胞表面。