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日本乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的人兽共患病。本病主要表现为神经性症状和猪的繁殖障碍,对人与养猪业危害巨大。目前基于流行优势株的改变、流行范围与分布的扩大,疫苗依旧是预防本病最有力的保障。本研究对JEV GZ株和SA14-14-2株在细胞上进行适应性培养,并进行鼠脑接毒,经过特异性设计6对引物,扩增pr M/M、pr M/E和NS1-NS2A(NS1-2A)基因并进行克隆,构建真核表达载体,生物信息学的分析并进行动物免疫试验,研究蛋白pr M/M、pr M/E和NS1-2A真核表达和免疫效果差异,以期为研究JEV的相关蛋白功能和进一步的疫苗研发奠定基础。将JEV GZ株和SA14-14-2株在BHK-21与Vero细胞上连续适应性传30代,观察JEV强、弱毒株在不同细胞上的细胞病变效应(CPE)和第5、10、15、20、25、30代的病毒滴度,结果显示:JEV强、弱株感染BHK-21细胞后的细胞病变效应(CPE)有明显差异,JEV弱毒株出现明显的CPE现象的时间要晚于强毒株;在不同细胞上接种JEV强、弱毒株,随着时间的延长细胞病变的数量会逐渐増加,且Vero细胞的病变特征与BHK-21细胞类似,但Vero细胞的细胞病变没有BHK-21细胞明显,这表明BHK-21细胞比Vero细胞适合该病毒的培养;JEV强弱毒株在BHK-21和Vero细胞上15代以后,病毒滴度维持在一个比较稳定的范围内,病毒含量较为稳定;通过强弱毒株对乳鼠的毒力测定,结果显示强毒(GZ株)比弱毒(SA14-14-2株)的致病性更明显。针对JEV GZ株和SA14-14-2株设计并合成6对特异性引物,利用RT-PCR方法分别从JEV GZ株和SA14-14-2株的细胞培养物的总RNA中扩增出pr M/M、pr M/E和NS1-2A基因,预期大小分别为501 bp、2001 bp和1737 bp,并将其分别克隆至p MD19-T载体,转化至DH5α感受态细胞中,并进行菌液PCR检测、双酶切和测序鉴定,结果表明:乙型脑炎病毒强弱毒株pr M/M、pr M/E和NS1-2A基因的克隆质粒构建成功。将pr M/M、pr M/E和NS1-NS2A基因克隆到pc DNA3.1(+)载体上,得到的重组质粒DNA经酶切鉴定,筛选出符合阅读框的重组质粒,构建重组质粒pc DNA3.1-pr M/M-r、pc DNA3.1-pr M/E-r、pc DNA3.1-NS1-2A-r、pc DNA3.1-pr M/M-q、pc DNA3.1-pr M/E-q和pc DNA3.1-NS1-2A-q(r表示弱毒SA14-14-2株,q表示强毒GZ株)。通过软件DNAstart(Meg Align)、Ex PASY(Protparam)、DNAstart(Edit Seq)、Prot Scale、DNAstart(Protean)程序和(http://smart.embl-heidelberg.de/)网站,分析目的基因片段序列与氨基酸的差异、蛋白氨基酸序列的理化性质、蛋白疏水性、蛋白的二级结构预测和蛋白跨膜情况。结果发现:弱毒株的pr M/E蛋白与强毒株相比在267-278位多形成一个低复杂区,氨基酸的改变没有影响蛋白结构域。将构建好的重组表达质粒进行转染,间接免疫荧光(IFA)和Western-boltting检测,发现转染24 h后的质粒能通过RT-PCR检测到相应的目的条带,通过间接免疫荧光技术检测到六种真核表达质粒在BHK-21中呈现出特异性绿色荧光,利用Western-boltting检测到约19KDa、72.4KDa和64.4KDa的特异性条带,结果证实真核表达质粒能在BHK-21细胞中表达并具有免疫学活性;将重组质粒对小鼠进行免疫,发现六种重组质粒均能诱导小鼠产生体液免疫,强毒组重组真核质粒在小鼠机体表达产生的免疫效果略优于弱毒组,其中免疫4周,重组质粒pc DNA3.1-pr M/M-r免疫组和pc DNA3.1-pr M/M-q免疫组差异明显(P<0.05),免疫6周,pc DNA3.1-pr M/E-q免疫组小鼠分泌的抗体水平极明显高于pc DNA3.1-pr M/E-r免疫组(P<0.01),pc DNA3.1-NS1-2A-r比pc DNA3.1-NS1-2A-q免疫组小鼠分泌抗体高(P>0.05)。通过小鼠攻毒保护实验发现重组质粒pc DNA3.1-pr M/M-q、pc DNA3.1-pr M/M-r和pc DNA3.1-pr M/E-r的保护率为30%,重组质粒pc DNA3.1-pr M/E-q和pc DNA3.1-NS1-2A-r的保护率为40%,重组质粒pc DNA3.1-NS1-2A-q的保护率为50%,减活疫苗的保护率为70%,这表明重组表达质粒针对JEV GZ毒株攻击能产生一定的保护效果。