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研究背景目前,胃癌已经成为一种全球性疾病,中国胃癌患者人数居高不下,我国也被称为胃癌大国。胃癌患者常常表现出三高三低的特征,即患病率、转移率和死亡率高;而早期诊断率、根治性切除率和5年生存率低。因此晚期胃癌患者治疗一直是临床亟待解决的问题。在晚期胃癌化疗治疗中,患者中位生存期（mOS）难以突破1年。一线治疗方案中,曲妥珠单抗在HER2阳性胃癌患者中获得了疗效改善。虽然曲妥珠单抗可以改善HER2阳性胃癌患者总生存期,但是一部分患者对曲妥珠单抗表现出耐药。因此研究胃癌靶向治疗耐药机制,逆转肿瘤耐药具有重要的临床价值。生物节律,又被称为分子时钟或者生物钟,是时间生物学的一部分。从分子角度上说,生物节律由复杂的转录-翻译网络组成,其中包括核心生物钟基因CLOCK、BMAL1、PER、CRY等。这些基因周期性表达,构成节律网络,驱动下游数千个靶基因节律性表达,从而调节生物体内功能及代谢。随着医学技术进步,生物节律也可以被用于预测或治疗疾病。目前研究发现,核心生物钟基因会对肿瘤发生发展及预后产生影响。生物节律不仅与肿瘤发生发展相关,同样与肿瘤耐药相关。研究方法和结果1.HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药后生物节律及代谢节律改变我们运用3D培养细胞模型,构建HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药细胞株SNU216-TR以及N87-TR,并运用细胞增殖实验以及蛋白免疫印迹实验,验证细胞耐药性。运用地塞米松同步细胞内生物节律,以地塞米松作用后2小时的时间记为ZTO,以4小时为时间间隔,在48小时内收集细胞。测定N87和SNU216两种HER2阳性胃癌细胞株中,敏感以及耐药细胞株核心生物钟基因RNA表达水平。我们发现相比于野生株,耐药株中肿瘤细胞生物节律被重置。通过蛋白免疫印迹实验以及动物实验,我们发现HER2阳性胃癌对曲妥珠单抗耐药后,糖酵解代谢水平增加,并呈周期性节律变化。其中糖酵解关键酶,己糖激酶2（Hexokinase2,HK2）变化最显著。在这一部分中,我们发现HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药后,肿瘤细胞生物节律被重置,时钟基因表达周期发生改变,肿瘤细胞糖酵解代谢节律同样发生变化。在本文研究中,我们不局限于探究肿瘤中基因组染色质序列改变,而是从第四维度——时间层面探究肿瘤耐药机制。2.BMAL1-CLOCK-PER1通过调控HK2导致曲妥珠单抗耐药在N87-TR以及SNU216-TR两种HER2阳性胃癌耐药细胞株中,我们运用小干扰RNA沉默11种核心生物钟基因,包括:BMAL1、CLOCK、PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2、REV-ERBα、REV-ERBβ、RORα、DBP。我们发现 BMAL1、CLOCK、PER1这3种关键时钟基因与糖酵解相关酶HK2表达显著相关,并通过检测糖酵解相关酶HK2活性、糖酵解产物ATP以及乳酸含量再次验证结论。为了进一步检测糖酵解相关酶HK2表达节律,将地塞米松作用后2小时的时间记为ZT0,在24小时内每4小时收集一次细胞。在BMAL1、CLOCK、PER1被敲低的N87-TR以及SNU216-TR耐药细胞株中,测定HK2的RNA含量。研究发现核心生物钟基因BMAL1、CLOCK、PER1表达节律被抑制后,糖酵解相关酶HK2表达水平下降,同时糖酵解代谢周期被重置,提示干扰生物钟后耐药细胞中糖酵解代谢节律发生变化。运用MTT细胞增殖实验和CCK8细胞增殖实验进行回复实验,发现核心生物钟信号轴BMAL1-CLOCK-PER1对HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药的影响,是通过扰乱糖酵解相关酶HK2表达节律进行的。在这一部分,我们发现关键生物钟基因通过驱动HK2依赖的糖酵解代谢节律,调控HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药3.PER1-PPARγ直接调控HK2表达节律分子生物钟经典机制中,BMAL1-CLOCK通过形成异源二聚体,结合下游基因启动子区E-box（Enhancer box）区域,从而启动下游基因转录。基于此,我们猜想BMAL1-CLOCK二聚体可能通过结合HK2基因启动子中E-box区域直接调控其转录。但是我们未在HK2启动子区域找到E-box经典结合区域。而对于E-box非经典区域,通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验发现BMAL1-CLOCK并不能通过结合E-box直接调控HK2转录。通过文献阅读,我们猜想时钟基因PER1同样参与HK2的调控。通过蛋白免疫印迹实验发现BMAL1-CLOCK是通过调节PER1从而调控HK2表达。进一步通过CoIP实验,发现PER1与PPARγ形成蛋白复合体,并且这种结合作用在生物体内节律性发生,进而调控下游HK2的表达周期以及肿瘤内糖酵解代谢节律。结论本文从第四维度——时间的层面探讨肿瘤耐药机制,观察肿瘤耐药后基因表达周期、代谢周期以及生物节律的变化。文章发现HER2阳性胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药后,肿瘤内关键生物钟基因表达周期发生变化,糖酵解代谢节律同样发生改变,肿瘤内生物节律被重新设定。进一步探究机制发现,核心生物钟信号轴BMAL1-CLOCK-PER1通过调控HK2表达节律,从而影响HER2阳性胃癌对曲妥珠单抗耐药。其中,PER1与PPARγ形成蛋白复合体,这种结合作用在生物体内节律性发生,从而调控HK2代谢节律,最终使肿瘤对曲妥珠单抗耐药。本课题从分子生物钟的角度探讨肿瘤靶向治疗耐药机制,为改善晚期胃癌患者曲妥珠单抗耐药提供了新的思路。