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猪消化道类病毒性疫病是近年来生猪养殖生产实践中最为普遍和突出的疾病,已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。许多国内外的研究表明:猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastro enteritis virus,TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)、猪轮状病毒A型(Porcine rotavirus groupA,PoRVA)和猪轮状病毒C型(Porcine rotavirus group C,PoRV C)是临床上引起猪消化道腹泻的主要病毒性病原,且常呈现出混合感染或继发感染,导致猪群的高发病率和高死亡率,加大了诊断和防治的难度。为了实现临床对猪消化道主要病毒性疫病多种病原体混合感染的快速确诊,本研究建立了针对上述病原体的五重RT-PCR检测方法并进行了初步应用,为猪消化道病毒性疫病病原的快速诊断和防控提供了有效的技术手段和理论参考依据。主要研究内容如下:1.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一RT-PCR检测方法的建立及检测参照Gen Bank上PEDVN(KT323979)、TGEVN(EU074218)、PDCoVN(MH715491)、PoRVAVP6(MH320796)、PoRV CVP6(KJ814472)等基因的部分序列片段,采用Primer Select等相关软件和平台,分别设计了5对用于扩增PEDVN、TGEVN、PDCoVN、PoRVAVP6和PoRV CVP6基因的部分片段的引物,大小分别为799 bp、375 bp、271 bp、525 bp和184 bp。将实验室检测呈PEDV、TGEV、PoRVA阳性的粪便样品及肠道组织等病料提取核酸和生物公司合成的含PDCoVN基因和PoRV C基因的部分片段的阳性质粒,分别以阳性病料的核酸和合成的质粒作为模板,通过对5种病毒单一RT-PCR扩增产物的鉴定,结果扩增出与预期相符的条带。将PEDV、TGEV、PoRVA的RT-PCR产物进行胶回收,并将胶回收后的产物与p MD-19T载体进行连接并转化入感受态细胞,通过对阳性克隆菌的筛选后提取相应的重组质粒,并以其中的5种重组质粒作为反应模板优化对单一病毒的PCR反应退火温度,并对敏感性进行检测,建立了能够用于PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒快速诊断的单一RT-PCR检测方法。结果显示:(1)最佳反应体系:5对引物浓度均为10μmo L/L,TGEV、PDCoV和PoRV C上下游引物各1μL,PEDV和PoRVA上下游引物1.5μL,模板各2μL,金牌Mi X(Green)补足25μL。(2)最佳反应条件为:94℃5 min(预变性);94℃45 s(变性);在51.0～60.5℃之间的退火温度条件下,PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一病毒RT-PCR均可扩增出特异的条带,但55.1℃45 s退火温度最佳;72℃45 s延伸,35个循环;72℃延伸10 min。(3)敏感性结果表明,上述5种病毒模板的最低核酸检测量分别为:PEDV 0.39 pg、TGEV 0.34 pg、PDCoV 0.35pg、PoRVA 0.37 pg和PoRV C 0.34 pg。2.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的建立在上述建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的五种病毒单一RT-PCR基础上,对PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR反应的体系进行调整,通过不断摸索模板和引物的用量、浓度以及退火温度的优化,并对五重RT-PCR的特异性、敏感性及重复性进行探索,建立了一种能够同时快速的鉴别PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒性疫病的五重RT-PCR检测方法。结果表明:(1)50μL体积是RT-PCR的最佳反应总体系。两步法的PCR体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,金牌Mi X(Green)补足50μL;一步法反应体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,2×1 Step Buffer 25μL,Prime Script One Step Enzyme Mix 2μL,RNase free water 8.5μL。(2)反应条件为:94℃5 min(预变性);94℃45 s(变性);55.1℃45 s(退火);72℃45s(延伸),35个循环;72℃10min(延伸)是最佳反应条件。(3)特异性、敏感性和重复性试验结果表明:五重RT-PCR能扩增出PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的特异性片段,分别为799 bp、525 bp、271 bp、375 bp和184 bp,未扩增出CSFV、JEV、PCV2、PRV及正常细胞组织的DNA/RNA;五重RT-PCR中各种病毒的最低核酸检测量分别为:PEDV 39 pg、TGEV34 pg、PDCoV35 pg、PoRVA37pg、PoRVC 34 pg。3.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的初步应用应用所建立的猪主要消化道病毒五重RT-PCR检测方法对2017～2020年间采集自贵州省内不同地区、不同规模化养猪场、农户散养等的临床病料共计523份进行了相关的检测。通过对病料进行检测,比较多重RT-PCR与单一RT-PCR的检测情况,结果表明:来自贵州省不同猪场的523份样品中,阳性率分别为PEDV 26.96%(141/523)、PoRVA13.96%(73/523)、TGEV 1.72%(9/523)、PDCoV 1.53%(8/523),未检测到PoRV C感染。PEDV+TGEV的二重感染阳性率为1.72%(9/523),PEDV+PDCoV的二重感染阳性率为1.53%(8/523),PEDV+PoRVA的二重感染阳性率为1.91%(10/523),未检测到三重及以上的感染现象,五重RT-PCR检测结果与单一RT-PCR方法的检测结果一致。