论文部分内容阅读
作为抗疟疾药物青蒿素的关键前体，青蒿二烯的异源合成近年来受到广泛关注。尽管青蒿二烯的异源合成已经达到了较高水平，构建功能酿酒酵母细胞合成青蒿二烯的关键是使外源功能模块和底盘细胞适配，外源模块与底盘细胞适配性的提高可以为产量的进一步提高提供可能。本研究首先使用着丝粒载体和附加型载体构建两种青蒿二烯功能模块，在过表达甲羟戊酸途径中关键基因（截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMGR、法尼基焦磷酸合酶基因ERG20）的两种酵母底盘中进行适配，得到适配性较好的功能酵母细胞，其产量为11.2mg/L，选用适配性最好的附加型载体与改造的W303a底盘细胞进行后续研究，进一步提高外源模块与底盘间的适配性。随后将青蒿二烯合酶基因ADS与ERG20进行融合构建融合蛋白功能模块，并采用不同强度的启动子（TDH1p、 TDH3p、TEF1p、PGK1p）对融合蛋白功能模块进行调控，其中PGK1p所调控的融合蛋白（ERG20-ADS）功能模块与底盘间的适配性最好，产量相较第一部分提高了5.4倍，达到71.8mg/L。最后，以20种基于BY4742的基因缺失酵母为底盘细胞，探究这些基因的敲除对于青蒿二烯合成的影响。结果表明，与野生型酵母BY4742相比，16种基因缺失酵母中青蒿二烯的产量体现出不同程度的提高或降低，证明这些基因的敲除对青蒿二烯的合成存在间接的作用。本研究通过对外源模块的载体类型、启动子强度、表达方式进行优化及与不同遗传背景的酵母底盘间的适配性研究，逐步提升了青蒿二烯在功能酵母细胞中的产量，研究的思路和手段可以为其他萜类化合物的相关研究提供借鉴。而对于基因缺失酵母合成青蒿二烯的研究，则不仅能够为青蒿二烯异源合成的进一步优化提供信息，而且也利于进一步探究这些不明晰功能的基因在酵母细胞中发挥的作用。