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目的： 通过对一例PLA2G6基因双位点突变的NBIA2B患者家系永生化淋巴细胞进行遗传学和分子生物学分析，探究PLA2G6基因exon2 c. 23T＞A (p. V8D) 和c.68G＞A (p. R23Q)这两个位点突变对细胞内铁硫蛋白和线粒体氧化呼吸链的功能是否产生影响，进一步阐明患者细胞内铁代谢异常及其致病的机制。 方法： 1. 建立永生化淋巴细胞系作为NBIA2B的细胞疾病模型 1.1.建立永生化淋巴细胞系 采集PLA2G6基因突变的NBIA2B患者及其父母的外周血，用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞，再利用EBV转化技术，建立永生化的淋巴细胞系。 1.2.检测永生化细胞的PLA2G6突变和铁代谢情况 根据临床提供的sanger测序结果，我们采用巢式PCR技术以患者及其父母永生化细胞的基因组DNA为模板，扩增出含两个有意义突变位点的序列，对扩增片段回收产物进行测序，检测患者及其父母携带的PLA2G6基因突变位点，同时在构建成功的永生化细胞中，通过biovision铁检测试剂盒检测细胞内的铁代谢情况，验证临床疾病NBIA2B的细胞疾病模型是否构建成功。 2. 检测PLA2G6基因突变对该基因表达的影响 为了检测PLA2G6基因突变是否对该基因的表达产生了影响，我们通过免疫印迹法检测了PLA2G6基因的蛋白表达水平。 3. 永生化细胞线粒体功能及亚显微结构的改变 患者临床表现为动作刻板，肌张力障碍，肌肉震颤等线粒体功能受损相关的临床表现，故我们利用荧光定量PCR，流式细胞仪等对线粒体ROS水平以及膜电位水平，线粒体拷贝数等线粒体功能相关变化指标进行了检测，并在透射电子显微镜下观察永生化细胞线粒体亚显微结构的改变。 4. 永生化细胞胞质及线粒体含铁硫簇蛋白表达及活性检测 为了探究PLA2G6基因突变导致的细胞内铁累积及线粒体功能紊乱与铁硫簇组装之间的关系，我们利用荧光定量PCR技术，免疫印迹法对永生化细胞线粒体、细胞质铁硫蛋白及线粒体氧化呼吸链中含铁硫蛋白丰富的复合体Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ的部分亚基进行了转录水平和蛋白表达水平检测，同时我们利用胶内酶活性分析法和紫外分光光度法对相关蛋白的活性变化进行了检测。 结果： 1. 患者及其父母永生化细胞PLA2G6基因突变位点及铁代谢检测 巢式PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析显示，患者父亲携带c.23T＞A (p.V8D)杂合变异位点，母亲携带c.68G＞A (p.R23Q)杂合变异位点，而患者携带c.23T＞A (p.V8D)和c.68G＞A (p.R23Q)两个突变位点；永生化细胞全细胞蛋白铁的含量检测结果表明，患者细胞内具有明显的铁代谢异常,铁的含量明显增多。 2. PLA2G6基因突变对其编码蛋白表达的影响 蛋白印迹结果发现患者及其父母的永生化细胞中PLA2G6基因不同位点突变对其编码蛋白的表达水平没有明显的影响。 3. 患者及其父母永生化细胞线粒体功能与线粒体亚显微结构的改变 线粒体功能检测结果表明患者永生化细胞线粒体ROS水平明显增高，膜电位水平下降。透射电镜观察结果显示线粒体形态畸变，体积变小，部分线粒体基质增多发生肿胀，线粒体嵴局灶性溶解断裂，数量明显减少。线粒体拷贝数检测结果表明患者细胞线粒体拷贝数增加。 4. 细胞质与线粒体中铁硫蛋白的表达及活性异常 4.1.细胞质及线粒体的铁硫蛋白检测结果发现患者永生化细胞线粒体[4Fe-4S]型铁硫蛋白NDUFS8，胞质[4Fe-4S]型铁硫蛋白DPYD和IREB2的蛋白表达水平明显下降，而细胞经蛋白酶抑制剂MG132以10μM的浓度处理24-48 h后，呈下降趋势的蛋白NDUFS8，IREB2和DPYD其表达水平得以恢复。 4.2.[4Fe-4S]型铁硫蛋白顺乌头酸酶表达结果显示患者永生化细胞胞质顺乌头酸酶的转录水平和蛋白表达水平无明显的差异，线粒体顺乌头酸酶的转录水平增高，蛋白表达水平无明显差异。通过胶内酶活分析法检测其活性结果显示胞质顺乌头酸酶（ACO1）活性下降，线粒体顺乌头酸酶（ACO2）活性没有明显的变化。 4.3.含铁硫蛋白丰富的线粒体复合体Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ的亚基NDUFS3、NDUFS8， SDHB，UQCRFS1在转录水平明显增高，而蛋白表达水平没有相应的增高。活性检测结果显示呼吸链复合体Ⅱ活性明显下降，复合体Ⅲ活性增高。作为对照，我们同时检测了不含铁硫蛋白的复合体Ⅳ，其活性是增高的。 结论： 根据实验结果可以得出以下结论： (1) 我们获得的永生化细胞与临床中PLA2G6基因突变的NBIA2B患者具有一致的有意义突变位点和铁代谢异常,可以作为我们进一步研究疾病机制的细胞模型； (2) PLA2G6基因exon2 c.23T＞A (p.V8D)和c.68G＞A (p.R23Q)两个位点突变的患者永生化细胞内可能存在铁硫簇组装障碍，导致细胞内的铁硫簇合成减少，使机体吸收的铁利用减少，从而成为细胞内铁累积的原因之一； (3) 线粒体氧化呼吸链中含铁硫簇丰富的复合体功能受损，进一步说明细胞内可能存在铁硫簇组装受抑，导致线粒体氧化呼吸链功能紊乱，进而加重线粒体的损伤。