前言目前研究表明,恶性肿瘤的发生与发展是一个多因素、多阶段的复杂过程,涉及多种基因的功能异常。引起基因表达异常的机制有两种：一为遗传学机制即DNA结构改变。二为表遗传学机制。表遗传学是研究非DNA序列变化引起的,可遗传的基因表达的改变。肿瘤发生中的主要表遗传学改变是肿瘤抑制基因发生DNA高甲基化和染色质中的组蛋白修饰。近几年来,表遗传学改变的研究取得了长足进展,也成为喉癌临床基础研究的前沿。现在普遍认为DNA甲基化是除缺失与突变之外导致基因失活的第三种机制,在肿瘤的发生发展中起着不可忽视的作用。肿瘤甚至可以被认为是由DNA的突变和表观遗传学的改变共同导致的,而且表观遗传学的变化在肿瘤发生中早于DNA的突变。组蛋白的甲基化作为另一种表遗传学机制,可以改变染色体的状态,进而调节基因的转录,间接导致肿瘤的发生。H3-K9甲基化可以抑制基因表达；而H3-K4甲基化则具有激活效应。H3-K9的甲基化与DNA的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用,而H3-K4的甲基化拮抗DNA甲基化所产生的基因沉默,研究表明在DNA甲基化及组蛋白甲基化之间存在着相互关系,在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。喉癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一,其发病率在我国北方地区位于头颈部恶性肿瘤的第一位,在我国南方地区,仅次于鼻咽癌居于第二位；在世界范围内,居于全身恶性肿瘤的第十一位。其发病率有逐年上升的趋势,大约占新发恶性肿瘤的1%左右。近30年虽然外科技术,放化疗手段不同程度的得到提高,但是目前喉癌仍是仅有的两个五年生存率未增长的肿瘤之一。原因之一就是目前喉癌发病的分子学机制仍不清楚,早期诊断及治疗不理想。因此深入研究喉癌的发病机制,寻找早期诊断及早期治疗的新靶点非常重要。有研究表明检测特定基因甲基化状态有望为肿瘤的早期诊断提供帮助,但目前在喉癌中的研究刚刚起步,比较理想的靶基因非常少。另外一个原因可能是喉癌的治疗方面不理想,目前在我国喉癌的治疗主要是手术治疗和放射治疗,手术给患者带来很大的痛苦,远期疗效尤其是晚期患者不尽人意,从长远看,化疗联合治疗方案更能够保全器官和功能,化疗效果值得深入研究,目前去甲基化治疗已经成为全世界肿瘤研究的热点,为攻克肿瘤这一顽疾提供新的思路。CHFR基因是一个新的有丝分裂前期检查点基因。在正常组织中广泛表达,位于纺锤体组装稽查点的上游。当存在有丝分裂应激时,CHFR通路激活,通过泛素化降解Plkl(Polo-like kinase 1),Plkl调控Cdc25和’Weel激酶的磷酸化,在G2期进入M期时控制Cdc2激酶的活性,而延迟染色体凝集,使细胞周期停滞于有丝分裂早期,纺锤体不能形成,直至错误被纠正。CHFR基因如发生改变不能阻断异常细胞通过G2期进入有丝分裂中前期,从而导致细胞的恶性增殖。已有研究发现,MAD,BUB等有丝分裂检查基因在多数肿瘤中很少失活,而CHFR在胃癌,肺癌,食道癌等恶性肿瘤中因启动子区甲基化表现为失活或低表达,与肿瘤的发生关系密切,因其具有肿瘤特异性,受到越来越多的人关注,而与喉癌发生的关系及DNA甲基化和组蛋白甲基化对其的调控目前国内外未见报道。目的通过探讨喉癌组织及Hep-2人喉癌细胞系中CHFR基因表达,启动子区甲基化以及组蛋白H3-K4,H3-K9甲基化,以及5-Aza-dC及TSA对基因表达和甲基化水平的影响,从而明确其与喉癌发生发展的关系,探讨喉癌的发生分子学机制及其早期诊断及治疗靶点。材料与方法一、实验对象Hep-2人喉癌细胞系、50例喉癌患者肿瘤及15例正常粘膜。二、实验方法1、细胞培养Hep-2人喉癌细胞按常规培养于含10%胎牛血清RPMI-1640的培养液,NaHCO2浓度2g／L,青霉素G浓度100U／L,链霉素浓度100μg／L,37℃含5%CO2的湿润空气的恒温密闭式培养箱培养。2、实验分组(1)Hep-2人喉癌细胞对照组：同期培养不加药的Hep-2人喉癌细胞。实验组：①5-Aza-dC组：加5umol/L 5-Aza-dC培养72小时；②TSA组：加TSA 300 nmol培养24小时；③5-Aza-dC及TSA组：加5umol/L 5-Aza-dC培养48小时后加TSA 300nmol继续培养24小时。(2)喉癌组织标本临床病例的收集：选择2008年1月-2009年1月中国医科大学附属盛京医院耳鼻喉科住院的喉鳞状细胞癌患者50例(喉癌组),男44例,女6例,年龄40-74岁,平均58±9.76岁。选取其中的15例喉全切除术标本中,距离肿瘤边缘>2.0cm的粘膜组织作为对照组。按照2002年UICC喉癌分期标准将本研究的喉癌标本进行分期：早期(Ⅰ期+Ⅱ期)22例(T1N0 5例T2N0 17例),声门上型12例,声门型10例。中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)28例(T2N1 1例,T2N2 1例,T3N0 9例,T3N18例,T3N2 4例,T4N0 7例),声门上型16例,声门型12例,所有喉癌组织均经病理证实为鳞癌。术前均未经放、化疗治疗。3、引物设计MSP、实时荧光定量PCR、CHIP引物序列和反应条件见表1-3,引物由TaKaRa公合成。4、甲基化特异性PCR (MSP)法检测DNA甲基化水平分别提取喉癌细胞系,喉癌组织中DNA。紫外分光光度仪定性、定量。亚硫酸氢钠修饰DNA, Wizard DNA Clean-up Systerm(Promega)纯化。离心沉淀DNA。采用甲基化特异性PCR方法。PCR反应条件：95℃12min后,95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,45个循环,72℃再延伸7min,琼脂糖凝胶电泳,EB染色。结果经Alpha Image 2000自动成像仪成像采集数据,分析电泳结果。实验重复三次,取其平均值进行统计分析。5、实时荧光定量PCR (Realtime fluro-genetic quantitative PCR)法检测mRNA水平用TRIzol试剂一步法分别提取喉癌细胞系,喉癌组织总RNA(按说明书进行)。按照反转录试剂盒说明将其反转录成cDNA第一链。无RNA酶的双蒸水将cDNA10倍稀释。进行荧光定量PCR扩增,由PCR反应曲线得到Ct值,以GAPDH为内参,采用2-ΔΔct方法进行相对定量。实验重复三次,取其平均值进行统计分析。6、染色质免疫沉淀分析(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)检测组蛋白H3K9,H3K4甲基化水平收集细胞,甲醛交联组蛋白和DNA。酶切后分别加H3-K9,H3-K4甲基化抗体,免疫血清或Tris-EDTA缓冲液。收集抗体／蛋白复合物,沉淀下来的染色质通过PCR扩增检测结果。结果经Alpha Image 2000自动成像仪成像采集数据,分析电泳结果。实验重复三次,取其平均值进行统计分析。7、Western Blot法检测CHFR蛋白、H3总蛋白、H3K9甲基化蛋白、H3K4甲基化蛋白水平提取蛋白,电泳,PVDF膜转膜,BSA封闭。分别加入CHFR, H3, H3K4甲基化、H3K9甲基化、actin兔单克隆抗体,然后加入单克隆二抗,成像,采集数据。采用条带密度值与相应actin密度值的比值作为指标进行比较,实验重复三次,取平均值进行分析。三、统计学处理应用SPSS17.0软件分析,mRNA表达水平定量测定结果用t检验,启动子甲基化结果用χ2检验(Fisher,精确概率法),mRNA的表达和临床病理参数的关系采用t检验,甲基化和临床病理参数的关系采用χ2检验。Western印迹的蛋白结果应用χ2检验统计,P<0.05,认为差异具有统计学意义。结果1、喉癌组织中CHFR基因启动子区甲基化情况在喉癌组织中,正常对照组未发现CHFR基因启动子区甲基化,在喉癌组中CHFR基因启动子区甲基化率为22%(11／50),两者相比,差异显著,有统计学意义(P<0.01)。其中T1+T2期10例,T3期1例,T4期未发现甲基化,T1+T2期甲基化率(41.6%1／24)明显高于T3+T4期(3.8%1／26),甲基化程度在临床T分期方面具有统计学意义P<0.01(x2=7.50)。而在年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、病理分化和有无淋巴结转移方面无统计学意义(P>0.05)。2、喉癌组织中CHFR基因mRNA表达CHFR基因在对照组mRNA全部表达。在喉癌组mRNA有2例表达缺失(4%),48例表达量明显下调,有统计学意义(P<0.01)。50例喉癌组织中,T1+T2期CHFR基因mRNA相对表达量0.29±0.18,T3+T4期相对表达量0.69±0.15,前者明显低于后者,两者差异有统计学意义(P<0.01),在不同的性别、年龄、肿瘤位置、分化程度和有无淋巴结转移方面CHFR基因mRNA水平没有统计学差异(P>0.05)。甲基化组CHFR基因mRNA表达量为0.16±0.13,非甲基化组mRNA表达量为0.65±0.17,前者明显低于后者,二者有密切关系。(P<0.05)。3、在Hep-2人喉癌细胞系中5-Aza-dC和TSA处理前后CHFR基因CHFR启动子区甲基化情况在Hep-2人喉癌细胞系中,CHFR启动子区表现为高甲基化,5-Aza-dC作用后DNA甲基化程度减弱,出现半甲基化,TSA作用后DNA甲基化程度无明显变化。联合使用5-Aza-dC+TSA后DNA甲基化程度明显减弱。4、在Hep-2人喉癌细胞系中5-Aza-dC和TSA处理前后CHFR基因mRNA表达情况同对照组比较,用5-Aza-dC作用后CHFR基因mRNA表达量上调(1.75±0.21)。用TSA作用后mRNA表达量(1.05±0.13)无明显变化。联合使用5-Aza-dC+TSA后mRNA表达量明显上调(2.15±0.18)5、在Hep-2人喉癌细胞系中CHFR基因启动子区组蛋白H3-K4甲基化,组蛋白H3-K9甲基化情况及与DNA甲基化的关系在Hep-2人喉癌细胞系中,CHFR基因启动子区组蛋白H3K9甲基化与DNA甲基化正相关,而组蛋白H3K4甲基化与DNA的甲基化负相关。基因启动子区组蛋白H3K9甲基化与DNA的甲基化在基因的表达下调机制中具有协同作用,而组蛋白H3K4甲基化拮抗DNA甲基化所产生的基因表达下调。6、在Hep-2人喉癌细胞系中,5-Aza-dC和TSA处理前后的CHFR基因启动子区域组蛋白H3K9甲基化、H3K4甲基化状态分析(1) 5-Aza-dC对启动子区域H3K9甲基化有明显作用,5-Aza-dC明显降低启动子区H3K9甲基化程度,TSA对启动子区甲基化无影响,联合给予5-Aza-dC和TSA与单独给予5-Aza-dC的作用相似。(2)5-Aza-dC对启动子区域H3K4甲基化的作用与对启动子区域H3K9甲基化的作用恰好相反,5-Aza-dC明显提高启动子区H3K4甲基化程度,TSA对启动子区域H3K4甲基化无影响,联合给予5-Aza-dC和TSA与单独给予5-Aza-dC的作用相似。7、Western Blot法分析喉癌组织中CHFR蛋白表达喉癌组46.0%(23／50)的喉鳞状细胞癌未检测到CHFR蛋白表达；所有黏膜均有CHFR蛋白表达。β-actin蛋白在喉鳞癌和正常黏膜中表达水平相似。CHFR蛋白表达水平的差异有统计学意义(χ2=13.85；P<0.001)8、Western Blot法分析5-Aza-dC和TSA处理前后Hep-2人喉癌细胞系中CHFR蛋白,H3蛋白,甲基化组蛋白H3-K9,甲基化组蛋白H3-K4表达5-Aza-dC作用后,CHFR蛋白表达量能明显增加,TSA对CHFR蛋白表达无明显影响,联合给予5-Aza-dC和TSA与单独给予5-Aza-dC的作用相似。5-Aza-dC及TSA作用后甲基化H3K9蛋白,甲基化H3K4蛋白,总H3蛋白无明显变化。结论1、在喉癌组织中抑癌基因CHFR启动子区CpG岛过甲基化与mRNA和蛋白表达缺失或下调有关,可能与喉癌的发生发展有关,与临床T分期的关系可能更为密切,检测其甲基化状态可有助于喉癌早期诊断。2、在Hep-2人喉癌细胞系中甲基转移酶抑制剂能够逆转抑癌基因CHFR启动子区甲基化状态,同时mRNA和蛋白表达上调,为临床治疗喉癌提供新思路。3、在Hep-2人喉癌细胞系中抑癌基因CHFR基因启动子区组蛋白H3K9甲基化与DNA甲基化在其基因转录调控中呈正相关,而组蛋白H3K4甲基化与DNA的甲基化呈负相关。DNA甲基化与组蛋白H3-K9甲基化在其基因表达缺失或下调中起协调作用,而DNA甲基化与组蛋白H3-K4甲基化起拮抗作用。4、在Hep-2人喉癌细胞系中甲基转移酶抑制剂能明显影响抑癌基因CHFR启动子区组蛋白H3K9甲基化和H3K4甲基化程度,而组蛋白脱乙酰基抑制剂对启动子区甲基化无明显影响。