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背景与目的:肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)恶性度高,发展快,绝大多数病人丧失手术时机,对放疗不敏感,所以一般只能化疗。但是目前肝癌化疗因靶向性不足或无靶向性、多药耐药性(Multiple Drug Resistance,MDR)快速形成两大瓶颈问题而使治疗效果不佳、毒性高、易复发。肝癌临床化疗一线药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)目前有其脂质体药物剂型(Lipo-DOX)上市,由于脂质体本身的性质,Lipo-DOX更易于与细胞膜融合,提高了 DOX的治疗效率,但由于没有靶向性而毒性仍然巨大!癌细胞对该药也可以快速建立MDR。本实验室前期筛选到了靶向肝癌细胞的12肽HCSP4,该多肽对HCC细胞、组织的靶向结合具有高度的特异性和敏感性。实验室前期分析预测miRNA1O1在HCC表达高度调低,可能具有抑制MDR的作用,并且构建了该miRNA的表达载体。本研究以实验室前期筛选的肝癌靶向多肽HCSP4为肝癌靶向导向元件,以我们预测的MDR可能的抑制性miRNA成员miRNA1O1与DOX一起制备了肝癌靶向DOX脂质体送药体系HCSP4-Lipo-DOX-miR101,以HCC细胞HepG2和阿霉素抗性HCC细胞(HepG2/ADR)为药物作用对象,在体外细胞水平研究了该脂质体药物对肝癌细胞的杀伤作用,本研究重点研究、分析了该脂质体药物对MDR的抑制的可能的机制。目的是为研发新型肝癌化学药物提供新的思路和积累实验基础,为解决癌症临床化疗面临的瓶颈进行尝试。本研究的主要特色及创新性有以下三点:(1)HCC的靶向性:(2)MDR关联性miRNA101的应用;(3)对药物的MDR的抑制机制的研究。方法:1.通过mirbase(http://www.mirbase.org),在线设计并确定miRNA的前体序列及插入片段,构建miRNA101表达质粒pcDNA6.2-GW/miRNA101。2.合成多肽HCSP4,利用薄膜超声分散法制备偶联HCSP4、包含阿霉素的阳离子脂质体,吸附 miRNA1O1 质粒,形成 HCSP4-Lipo-DOX-miR101。3.利用扫描、透射电镜、粒度衍射分析仪等对制备的脂质体进行质控分析。4.以 pcDNA6.2-GW/EnGFP 质粒代替 pcDNA6.2-GW/miRNA101 在荧光显微镜下分析HCSP4-Lipo-DOX-miR101的靶向性、转染效率,确定最佳转染条件。5.利用MTT、流式细胞仪、损伤修复法、Transwell、扫描电镜、DAPI染色等方法对HCSP4-Lipo-DOX-miR101的体外疗效进行评估。6.通过半定量 PCR 和 Western blot 研究 HCSP4-Lipo-DOX-miR101 在 HCC 治疗和抗MDR中的可能机制。7.miR101及其靶基因与MDR的关系的在线数据库分析。结果:1.成功制备了 HCSP4-Lipo-DOX-miR101,质控结果显示,脂质体呈球形、粒径在100-135nm之间、大小均一、药物包封率达到了 90%。2.体外实验结果证实HCSP4-Lipo-DOX-miR101对HCC细胞具有良好的靶向性。3.通过MTT和平板克隆形成实验证实了 HCSP4-Lipo-DOX-miR 101明显增强DOX对HCC细胞的杀伤力。4.利用损伤修复、transwell、考马斯亮蓝、流式细胞仪、DAPI染色及扫面电镜实验,证明了 HCSP4-Lipo-DOX-miR101明显增强DOX对HCC细胞恶性表型的抑制力。5.RT-PCR 实验结果显示 HCSP4-Lipo-DOX-miR101 抑制了 ABCC5、COX-2、P-GP的 mRNA 表达水平;Western blot 结果显示,miR101 抑制了 ABCC5、P-gp、STX1A、APEX1、ITGB1、EZH2 的表达。结论:1.HCSP4-Lipo-DOX-miR101对培养的HCC细胞具有明显的靶向性;2.HCSP4-Lipo-DOX-miR101对培养的HCC细胞具有明显的杀伤增强能力,更重要的是,对具有DOX抗性的HCC细胞(HepG2/ADR)具有明显的杀伤作用;3.HCSP4-Lipo-DOX-miR101对DOX MDR的抑制或逆转作用可能通过miR101对 ABCC5、P-gp、STX1A、EZH2、APEX1、ITGB1 等基因表达的抑制来实现;4.HCSP4-Lipo-DOX-miR101对培养的HCC的治疗具有如下两方面重要特征:(1)HCSP4介导的HCC高度靶向性基础上的HCC治疗效率的大幅提高和毒性的明显降低;(2)miR101介导的DOX的MDR的明显抑制或逆转。而在这两项基本作用下,该靶向载药体系对HCC的治疗可能能够达到高效、低毒、抗MDR、抗复发等效果,而这正是目前肝癌及其它癌症临床治疗急需要解决的瓶颈问题!