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帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是最常见的中枢神经系统退行性疾病之一仅次于阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)。临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势步态障碍等运动症状,同时患者可伴有抑郁和睡眠障碍等非运动症状。其主要病理改变为黑质(substantia nigra, SN)多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡,由此而引起的纹状体DA含量显著性减少。目前,PD的确切病因仍不清楚,包括遗传因素和非遗传因素。非遗传因素中,氧化应激、线粒体功能障碍、炎症、蛋白异常聚集、凋亡、铁的过度沉积等均可能参与了PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。在这些病因中,铁的异常聚集越来越受到研究人员的关注,之前大多研究都把焦点放到了黑质本身,很少关注其他脑区的铁代谢情况。而黑质过多的铁究竟来源于哪里?是否来源于其他脑区?本研究在正常人和PD病人死后的脑组织中,应用ICP方法,测定了大脑颞叶皮层铁、锰、镍和铜四种过渡金属元素的含量,并且应用免疫印记法观察了该脑区铁转运相关蛋白,二价金属离子转运蛋白-1(divalent metal transporter1, DMT1),转铁蛋白受体-1(transferrin receptor1, TfRl)和铁转出蛋白ferroportin1(FPN1)的表达变化,同时观察了其共同的调节蛋白铁调节蛋白(iron regulatory protein1, IRP1)的变化。同时应用AD脑组织标本作为阳性对照。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)是一种诱导型应激反应蛋白。尸检结果证实,PD病人SN区的星形胶质细胞和Lewy小体中HO-1水平较正常人明显增高,提示HO-1在PD病理过程中发挥了重要作用。HO-1能够分解血红素生成游离的铁,一氧化碳和胆绿素。后两者在体内有强的还原活性而对细胞起到保护作用,而游离铁可能通过Fenton反应加重氧化应激损伤。目前的研究多集中于HO-1表达调控对细胞的保护性作用,而HO-1在这两种细胞中的表达方式及作用是否有差异,其是否参与了PD中神经元和胶质细胞的不同易感性没有相关研究报道。本实验应用原代细胞培养、免疫印迹、流式细胞术、激光共聚焦扫描技术等多项研究方法,观察了神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)和a-突触核蛋白处理后,腹侧中脑(ventral mesencephalon, VM)(?)神经元和星形胶质细胞HO-1时间依赖性表达以及HO-1活性改变后两种细胞对神经毒素的易感性,即线粒体跨膜电位差(Mitochondiral membrane potential,△ωΨTm)的变化。研究结果如下：1、PD组颞叶皮层Fe含量为110.30±3.98ng/mg,较正常对照组(131.25±7.37ng/mg)相比明显降低,差别有统计学意义(P<0.05)。AD组无明显变化。Mn、Ni和Cu的含量,PD组和AD组较正常组均无明显变化。2、PD组颞叶皮层DMT1、TfR1、FPN1、IRP1蛋白表达水平均明显降低,与正常对照组相比,分别降低22.22%、14.23%、21.11%和36.9%。差别有统计学意义(P<0.05)。AD组无明显变化。3、100μM MPP+处理体外培养的VM神经元1h、4h、12h、24h,HO-1蛋白表达水平于24h时开始升高。5μg/ml α-突触核蛋白处理30min、2h、4h、12h、24h、48h,HO-1表达水平于12h时开始升高,且于24h到达峰值,48h下降。4、100μMMPP+或5μg/ml α-突触核蛋白处理体外培养的星形胶质细胞30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h, HO-1表达水平于1h时开始升高,并于12h到达高峰。5、100μm MPP+处理VM神经元4h或5μg/ml α-突触核蛋白处理VM神经元1h,细胞的ΔΨm明显降低,较正常对照组相比,差别具有统计学意义(P<0.05or0.01)。应用HO-1激活剂原卟啉Ⅸ氯化钴(protoporphyrin IX cobalt chloride, Copp)(5μM)预处理24h,可阻断由MPP+或α-突触核蛋白诱导的Δψm的降低,而HO-1抑制剂原卟啉Ⅸ锌(protoporphyrin IX zinc, Znpp)(5μM)预孵育对MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm的变化没有影响,但可完全阻断Copp的作用。6、100μMMPP+处理VM星形胶质细胞4h或5μg/m α-突触核蛋白处理1h,△Ψm较正常对照组相比均明显降低；与5μMCopp预处理24h后,MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm下降可恢复至接近正常水平；5μM Znpp共孵育使MPP+或α-突触核蛋白诱导的ΔΨm降低更加明显,且可完全阻断Copp对MPP+或α-突触核蛋白的保护作用。7、100μMMPP+或5μg/ml a-突触核蛋白处理VM神经元24h,ΔΨm较正常对照组相比均明显降低；5μM Copp预处理24h后,MPP+诱导的△甲m降低更加明显,但可以轻微阻断α-突触核蛋白诱导的△甲m降低；5μM Znpp共孵育使MPP+或a-突触核蛋白诱导的ΔΨm降低更加明显,但可完全阻断Copp的上述作用。8、100μMMPP+或5μg/mlα-突触核蛋白处理VM星形胶质细胞24h,△Ψm较正常对照组相比均明显降低；MPP+或α-突触核蛋白与Copp共孵育24h,VM星形胶质细胞△Ψm恢复至正常水平；5μM Znpp共孵育使MPP+或α-突触核蛋白诱导的△Ψm降低更加明显,但可完全阻断Copp对MPP+或α-突触核蛋白的保护作用。9、100μM的MPP+或5μg/ml的α-突触核蛋白处理VM星形胶质细胞12h,△Ψm较正常对照组相比明显降低；1μM Copp共孵育12h,可部分阻断MPP+或Ⅸ-突触核蛋白诱导的ΔΨm下降；5μM Copp共孵育12h,ΔΨm恢复至接近正常水平。10、10μM和25μM的Copp处理VM神经元48h,内源性α-突触核蛋白水平较正常对照组相比均明显降低,且25μM组较10μM组相比降低更加明显。上述结果表明,PD病人大脑皮层颞叶铁水平存在异常,且可能与铁代谢相关蛋白的异常表达有关；MPP+和α-突触核蛋白均可诱导VM神经元和星形胶质细胞中HO-1的表达上调,但星形胶质细胞HO-1的上调明显早于神经元。MPP+和α-突触核蛋白均可诱导VM神经元和星形胶质细胞中ΔΨm的下降。抑制HO-1可加重MPP+和α-突触核蛋白诱导的线粒体损伤。激活HO-1对于星形胶质细胞始终具有线粒体功能的保护性作用,而HO-1的过量表达可加重神经元的损伤。神经元HO-1表达上调会降解内源性α-突触核蛋白。本研究首次证实PD病人颞叶铁及铁代谢相关蛋白水平存在异常,并作出颞叶和主要病变区-黑质之间存在铁的重新分布这一假设,为黑质区异常聚集铁的来源研究提供了一个可能的病理途径。另外,对于细胞易感性的探讨证实,神经毒素MPP+和α-突触核蛋白诱导的HO-1上调在神经元和星形胶质细胞中具有保护作用。星形胶质细胞中HO-1的更早上调可能是其不易受损的原因。神经元中HO-1的过量表达可能是其更易受损的原因。HO-1的激活可能参与了α-突触核蛋白的降解。本研究首次证实HO-1可能参与了VM神经元和星形胶质细胞对神经毒素的不同易感性,从而为星形胶质细胞HO-1调控在PD神经保护中的作用研究提供了实验基础,为寻找可能的靶向性治疗方案和进一步解释PD中神经元而不是胶质细胞选择性死亡的原因提供实验依据。