研究背景：　　 急性白血病是儿童最常见的恶性肿瘤之一。根据增生的白细胞种类不同,急性白血病可分为急性淋巴细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病两大类,其中ALL占70％,它是以骨髓中的淋巴样祖细胞和淋巴细胞前体增殖失控和成熟障碍为特点的一种异质性疾病,不同亚型的ALL发生率与不同的年龄、种族和社会环境有关,其白血病细胞具有广泛多样的表型,且对化疗药物的反应也不尽相同。　　 儿童ALL的病因尚未明了,可能由于基因-环境的相互作用引起与调节正常血细胞生成和造血微环境有关的基因易位、缺失和倒置而发病。传统流行病学研究表明,在相同的环境暴露下不同个体对疾病的易感性存在差异。在阐明个体对环境危险因素的易感性与耐受性、疾病的发生发展、临床表现的多样性以及对化学药物的疗效与毒性反应等方面,基因多态性均起着重要的作用,而所谓的基因多态性,是指在一个生物群体中,同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或等位基因。基因多态性通常分三大类:(1)限制性长度多态性；(2)DNA重复序列多态性；(3)单核苷酸多态性。　　 虽然目前公认遗传变异在决定个体肿瘤易感性中的扮演重要角色,但关于基因多态性与儿童白血病易感性的关系研究并不多见。一方面,外源性化合物代谢酶如谷胱甘肽S-转移酶家族(glutathione S-transferases,GSTs)中的基因多态性可使酶活性减低甚或缺如,对致突变物质如多环芳香族碳氢化合物(Polycyclie aromatic hydrocarbons,PAH)、烟草、环氧化物的解毒作用减弱,从而引起细胞遗传物质损伤；另一方面,由于叶酸的缺乏以及叶酸代谢酶的基因多态性如还原叶酸载体基因(Reduced folate carrier,RFC1)、亚甲基四氢叶酸还原酶基因(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)等均可能改变DNA的合成、修复、甲基化功能,在ALL的形成中起着重要作用。　　 尽管通过多药联合化疗儿童ALL的5年无事件生存率(event free survival,EFS)已达到80％以上,治疗ALL的化疗药物通常治疗指数较小,临床化疗中往往很难预测白血病细胞对药物的反应和机体毒性,因此化疗药物的应用及疗效就受到很大的限制,集中表现为化疗药物在患者中的药物动力学、效应和毒性方面显著的个体差异。治疗相关的毒副反应不仅能影响患儿的生活质量,也是引起化疗中断和终止的主要因为,而后者可导致相当一部分ALL儿童在化疗过程中或化疗结束后出现复发,甚至威胁ALL儿童的生命。　　 抗叶酸代谢药物甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)用于肿瘤治疗已逾50年,是ALL化疗方案中的重要组分。MTX为叶酸类似物,主要借助于RFC的转运进入细胞,入胞后MTX可直接以原形和二氢叶酸竞争与二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase,DHFR)结合,从而无法还原成有活性的四氢叶酸,同时进入细胞的MTX在甲氨蝶呤聚谷氨酸合成酶(Folypolyglutamate synthetase polyglutamine,FPGS)的催化作用下,在MTX的γ-羧基位上加上约7-10个谷氨酸残基,形成MTX多聚谷氨酸(methotrexate polyglutamine,MTXPG),多聚谷氨酸化可增强MTX的作用,抑制胸苷酸合酶(Tymidylate synthase,TS)和甲酰基转移酶(Glycinamide ribonucleotide formyltransferase,GARTFase),并由于快速出胞被阻断使IdTX胞内滞留时间延长。因缺乏四氢叶酸,一碳单位形成减少,DNA、RNA合成受限,快速增生的肿瘤细胞如淋巴母细胞因缺乏复制所需的原料而逐渐死亡。故MTX可以通过原形及MTXPG的形式抑制细胞嘌呤的合成过程,造成细胞死亡,从而产生抗肿瘤作用。大剂量甲氨蝶呤(high dose methotrexate,HDMTX)可通过渗透直接进入细胞,是ALL 维持治疗及髓外白血病的防治的重要措施,然而,也常引起皮肤、肝脏、消化系统、泌尿系统、中枢神经系统和骨髓等发生严重的毒副反应。其治疗过程中相当一部分患者会出现毒副反应,一部分则无任何毒副反应,另一部分患儿白血病细胞对MTX反应低下甚至可引起化疗失败。药物代谢是药物在体内消除的主要途径,药物代谢酶(drug metabolismenzymes,DME)在药物的代谢解毒和代谢活化中起着重要的作用。近来,一些研究表明,药物代谢酶的基因多态性在儿童ALL化疗的疗效和毒副反应中有着非常重要的作用。与MTX代谢相关的DME主要有叶酸代谢途径中的亚甲基四氢叶酸还原酶,以及属于Ⅱ相代谢酶的谷胱甘肽S-转移酶等,这些酶的基因均具有遗传多态性,在一定条件下可以被诱导,存在着个体间的差异。　　 在此,我们筛选了叶酸代谢途径中的还原叶酸载体基因和亚甲基四氢叶酸还原酶基因,以及谷胱甘肽S-转移酶家族的部分基因GSTP1、GSTId1和GSTT1作为候选基因,旨在研究RFC1 A80G、MTHFR C677T、GSTP1 A313G、GSTM1和GSTT1阳性型/缺失型的多态性与儿童ALL易感性之间的关系；并探讨它们对ALL儿童使用HDMTX化疗的毒副反应以及MTX排泄延迟的影响,以期为儿童ALL的预防和个体化治疗和提供参考依据。　　 第一部分 药物代谢酶基因多态性与儿童急性白血病易感性的关系　　 目的：研究RFC1 A80G、MTHFR C677T、GSTP1 A313G、GSTM1和GSTT1阳性型/缺失型的多态性与儿童ALL易感性的关系。　　 方法：本组为病例对照研究,病例组为45例ALL 患儿,对照组为70例健康儿童。分别留取外周血标本,提取基因组DNA,采用DNA直接测序法测定其RFC1 A80G、MTHFR C677T、GSTP1 A313G的基因型,用多重PCR技术测定其GSTM1和GSTT1的基因型。所有实验数据均用SPSS 13.0软件进行处理和分析,采用x2检验比较它们在两组之间的基因型分布差异,以Logistic回归分析各基因多态性与ALL的危险度,P<0.05为差异有统计学意义。　　 结果　　 ①ALL组的RFC180位点的基因型分布与对照组相比较,差异有统计学意义(x2=7.633,P=0.02)。与RFC180GG基因型者比较,携带80AA基因型者ALL风险增加4.15倍(校正OR=4.15,95％CI:1.29-13.38)；　　 ②ALL组的MTHFR 677位点的基因型分布与对照组相比较,差异无统计学意义(x2=4.379,P=0.11),与MTHFR 677CC基因型者相比较,携带677CT基因型者ALL的风险降低2.56倍(校正08=0.39,95％CI:0.16-0.93),且677CT+TT基因型的儿童患ALL的风险降低了2.27倍(校正OR=0.44,95％CI:0.20-0.98)；　　 ③ALL组的GSTP1313位点的基因型分布与对照组相比较,差异无统计学意义(x2=0.577,P=0.45)；与GSTP1 A/A基因型携带者相比,G/G基因型者发生ALL的危险性无显著升高(校正OR=1.07,95％CI:0.13-8.52)；　　 ④GSTM1和GSTT1基因缺失频率在ALL组和对照组差异均无统计学意义。　　 结论RFC1A80G和MTHFRC67T多态可能为儿童急性白血病发病的易感因素,值得进一步进行功能学探讨及大样本人群验证。　　 第二部分 药物代谢酶基因多态性与急性白血病儿童甲氨碟呤毒副反应的关系　　 目的：研究RFC1 A80G、MTHFR C677T、GSTP1.A313G、GSTM1和GSTT1阳性型/缺失型对ALL患儿使用HDMTX化疗的毒副反应以及MTX排泄延迟的影响。　　 方法：筛选ALL患儿40例,提取其基因组DNA,用DNA直接测序法检测RFC180、MTHFR 677、GSTP1313基因型；用多重PCR技术测定其GSTM1和GSTT1的基因型。观察所有患者经HDMTX化疗后的毒副作用,并应用荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization Immunoassay,FPIA)测定MTX血药浓度。所有实验数据均用SPSS 13.0软件进行处理和分析,以Logistic回归分析基因多态性与毒副反应的危险度；采用Fisher精确概率比较HDMTX化疗后RFC1、MTHFR、GSTP1基因的不同基因型之间的48小时MTX血药浓度的差异,以x2检验比较GSTM1和GSTT1基因的不同基因型之间的48小时MTX血药浓度的差异,P〈0.05为差异有统计学意义。　　 结论：RFC1 A80G多态性与ALL儿童的HDMTX化疗所致的骨髓抑制相关；MTHFRC677T基因多态性与肝脏损害相关,其与MTX排泄延迟亦有关。