研究证明乳酸是机体的重要能量物质之一,在机体内广泛存在乳酸穿梭现象。心肌是具有高度氧化特性的肌肉,心脏能够主动利用乳酸作为能源物质。同时研究发现,当血液中的乳酸通过血液循环经过心脏组织,随着心肌摄氧量的增加,心脏优先选择的能量供应物质是乳酸,这主要是由于心肌中有大约60%的底物能够利用乳酸,心脏细胞间乳酸穿梭有待进一步研究。缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury, IRI)好发于对氧需求较高的组织器官如心、脑等。迄今为止缺血再灌注的机制并未完全阐明,目前普遍认为能量代谢变化参与了心肌细胞缺血以及缺血后再灌注受损,因血流的变化而产生氧供及代谢失衡,进而能量供应不足,加之中间环节受阻,代谢产物如乳酸等堆积,导致心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血损伤本质上是因为缺氧导致的能量供应不足,导致离子通道障碍和氧自由基等大量产生,由此我们推测：在心肌缺血再灌注损伤中是否存在乳酸穿梭现象,即缺血期间转出乳酸以利于糖酵解持续进行,而再灌注期间转入乳酸利于氧化；这种乳酸穿梭是否对心肌具有保护作用。本研究分三部分,分别依次从分子水平研究心脏在缺血再灌注乳酸穿梭相关蛋白MCT1,MCT4表达变化；其次用干扰RNA技术沉默MCT表达后研究心肌细胞缺血再灌注时细胞活力和凋亡的变化；最后研究在缺血再灌注期间临床能量代谢药物曲美他嗪对心肌细胞乳酸穿梭系统的影响,为将来乳酸穿梭在临床的应用做好前期基础研究。第一部分心肌细胞缺血再灌注期间乳酸穿梭相关蛋白表达变化[目的]研究心肌缺血再灌注损伤时乳酸穿梭相关蛋白和乳酸浓度的变化,以探讨心肌细胞在缺血情况下是否存在乳酸转出,而在再灌注期间,是否又将乳酸转运至细胞内。[方法]采用胚胎大鼠心肌细胞系H9C2细胞放置于95%N2+5%CO2培养箱中做缺氧培养,缺血模型分为0h,1h,2h,4h,8h,12h共6组,其中0h为正常生长细胞,设为对照组。H9C2细胞缺氧培养4h后,往细胞培养液中添加5ml含10%胎牛血清的正常DMEM培养基,再将细胞置于37℃,95%空气,5%CO2的正常培养箱中培养,为心肌细胞复氧,再灌注模型分为1h,4h,8h,12h,24h共5组。用流式细胞仪检测缺血4h后细胞凋亡率,以验证H9C2细胞缺血再灌注模型是否符合实验要求。将H9C2细胞免疫荧光组织化学染色,加入一抗(MCT1, MCT4)、FITC标记二抗,同时加DAPI染细胞核,每个载玻片上加入15μl抗淬灭剂,37℃孵育30分钟,封片后进行荧光显微成像拍照。采用Trizol法提取H9C2心肌细胞总RNA,逆转录cDNA,用SYBRGreen荧光染料行实时定量PCR反应。提取H9C2心肌细胞蛋白并行Western blot实验,BCA法行蛋白含量测定。SDS-PAGE电泳后蛋白质转膜、封闭、杂交,行化学发光、显影、定影和凝胶图像分析来反映蛋白的相对水平。测定细胞上清液的乳酸浓度。以上所有实验至少重复3次。[结果]用流式细胞仪检测缺血4h后细胞凋亡率,结果显示符合模型要求。1.正常情况下H9C2细胞MCT1,MCT4表达结果：1)免疫组化结果显示H9C2细胞正常情况下MCT1大量表达,而MCT4表达量少。2)Western-blot结果显示在正常H9C2细胞中,MCT1表达量多,而MCT4表达量少。与既往研究结果相一致,说明H9C2细胞是研究乳酸穿梭相关蛋白的合适实验载体。2.H9C2细胞在缺血时MCT1,MCT4mRNA变化：实时荧光定量RT-PCR结果提示在缺血期间,随着缺血时间的延长,MCT4mRNA的表达量逐渐增多,在缺血4小时后表达量的增加最为明显(P<0.05)。MCT1mRNA的表达量在缺血4小时后开始下降。3.H9C2细胞在再灌注时MCT1,MCT4mRNA变化：实时定量RT-PCR结果提示在再灌注期间,随着灌注时间的延长,MCT1mRNA的表达量逐渐增多,在再灌注8小时时升高明显,12h达到最高峰(P<0.05)。MCT4mRNA的表达量在再灌注期间表达下降,8小时后表达量下降明显(P<0.05)。4.H9C2细胞在缺血时候MCT1,MCT4蛋白表达变化：Western-blot结果提示在缺血期间,随着缺血时间的延长,MCT4蛋白的表达量逐渐增多,在缺血4小时尤为显著(P<0.05),而后维持在该水平。MCT1蛋白的表达量在缺血4小时后表达略有下降,但无统计学意义(P<0.2)。5.H9C2细胞在再灌注时MCT1,MCT4蛋白表达变化：Western-blot结果提示在再灌注期间,随着再灌注时间延长,MCT1表达有增多趋势,再灌注后8小时时增多明显(P<0.05)。而MCT4随着时间延长表达量有下降趋势,在8小时左右下降明显。6.细胞上清液的乳酸浓度变化：随着缺血时间的延长,乳酸浓度逐渐升高,在缺血4小时乳酸浓度升高幅度最大；在再灌注期间,随着灌注时间的延长,乳酸浓度逐渐下降,再灌注8小时下降幅度最大。该结果与乳酸穿梭相关蛋白的表达变化一致。[结论]缺血时心肌细胞的MCT4表达显著增多,细胞上清液中的乳酸浓度升高；再灌注时心肌细胞的MCT1表达增多,细胞上清液中乳酸浓度降低。由此推断缺血再灌注期间存在乳酸穿梭。第二部分乳酸穿梭在心肌细胞缺血再灌注期间作用研究[目的]通过观察沉默MCT表达后,H9C2细胞在缺血再灌注时细胞活力和细胞凋亡的变化,来证实乳酸穿梭在心肌缺血再灌注中的作用。[方法]H9C2细胞培养和传代后,用MCT siRNA转染H9C2细胞,加入8μg合成的MCT-RNAi片段与20μl脂质体的无血清DMEM培养基混合物中,37℃,5%的C02培养箱中培养,48h后收集细胞：转染效率用免疫荧光鉴定,RNA干扰效果用Westen-blot鉴定。将H9C2细胞免疫荧光组织化学染色,加入一抗(MCT1, MCT4)、 FITC标记二抗,同时加DAPI染细胞核,每个载玻片上加入15μl抗淬灭剂,37℃孵育30分钟,封片后进行荧光显微成像拍照。提取H9C2心肌细胞蛋白并行Western blot实验,BCA法行蛋白含量测定。SDS-PAGE电泳后蛋白质转膜、封闭、杂交,行化学发光、显影、定影和凝胶图像分析来反映蛋白的相对水平。用AnnexinV—ITC细胞凋亡检测试剂盒检测心肌细胞凋亡率,流式细胞仪分析细胞凋亡结果,MTT比色法分析细胞存活率。收集细胞后裂解细胞,取细胞裂解液的上清,5μl上清用Bradford法进行蛋白定量,测定A595值；45μl上清加50μl2x反应缓冲液及5μ1Caspase作用底物,37℃孵育1h,分光光度计测定光密度值(0D405),计算Caspase活性(A405值/A595值)。[结果]1.MCT siRNA转染效率的测定：细胞转染48小时后,每孔寻找3个具有代表性的视野,各观察100个细胞,三个视野中转染MCT siRNA效率分别为93%、86%、91%,已能满足下一步的实验要求。2.转染混合物对转染H9C2细胞的毒性检测：MTT检测结果发现60pmol的siRNA用LipofectamineTM2000转染后细胞存活率均>85%,符合实验要求。3.MCT siRNA对MCT1,MCT4蛋白沉默效率：Western blotting进一步检测结果显示：用化学合成的MCT siRNA在转染H9C2细胞48h后蛋白条带明显变淡,说明细胞中MCT1,MCT4蛋白表达量明显减少。4.用MCT siRNA转染H9C2细胞48h后,和正常H9C2细胞对照,沉默MCT表达,发现在缺血期和再灌注期细胞的活力下降,凋亡增多。5.用MCT siRNA转染H9C2细胞48h后,和正常H9C2细胞对照,Caspase-3活性定量检测结果显示,在缺血期,Caspase-3活性逐渐升高,但MCT siRNA可进一步促进其活性的增高；在再灌注前期,Caspase-3活性逐渐升高,但MCT siRNA可进一步促进其活性的增高。[结论]利用干扰RNA技术沉默MCT的表达,该技术沉默效率好,细胞毒性小,是一种良好的基因敲除手段。通过对MCT基因沉默,我们发现在缺血期和再灌注期细胞的活力下降,凋亡增多,说明乳酸转运相关蛋白MCT介导的乳酸穿梭在心肌细胞的缺血再灌注过程中具有重要的保护作用。第三部分曲美他嗪对心肌细胞缺血再灌注乳酸穿梭作用的影响[目的]研究大鼠心肌细胞缺血再灌注时曲美他嗪对乳酸穿梭相关蛋白的表达影响。[方法]H9C2细胞培养和传代后,采用胚胎大鼠心肌细胞系H9C2细胞放置于95%N2+5%C02培养箱中做缺氧培养,H9C2细胞缺氧培养4h后,往细胞培养液中添加5ml含10%胎牛血清的正常DMEM培养基,再将细胞置于37℃,95%空气,5%C02的正常培养箱中培养。缺氧再灌注模型均分为对照组和曲美他嗪实验组。采用Trizol法提取H9C2心肌细胞总RNA,逆转录cDNA,用SYBRGreen荧光染料行实时定量PCR反应。提取H9C2心肌细胞蛋白并行Western blot实验,BCA法行蛋白含量测定。SDS-PAGE电泳后蛋白质转膜、封闭、杂交,行化学发光、显影、定影和凝胶图像分析来反映蛋白的相对水平。流式细胞仪分析细胞凋亡结果,MTT比色法分析细胞存活率。收集细胞后裂解细胞,取细胞裂解液的上清,用Bradford法进行蛋白定量测定,测定A595值；取部分上清加50μl2×反应缓冲液及5μl4nM DEVD-PNA作用底物,对照组不加底物,37℃孵育1h,分光光度计测定光密度值(0D405),计算Caspase活性。[结果]1.形态学变化：曲美他嗪细胞组细胞在缺血再灌注过程中,其生长状态明显好于对照组细胞,死亡和凋亡细胞明显低于对照组。2MCT mRNA结果：实时荧光定量PCR结果显示,曲美他嗪组细胞在缺血期MCT4表达明显高于对照组,而MCT1表达量无统计学意义；再灌注期间,曲美他嗪组MCTl表达量明显高于对照组,MCT4表达量无统计学意义。3.Western-blot结果：显示曲美他嗪组细胞在缺血期MCT4表达明显高于对照组,而MCT1表达量无统计学意义；再灌注期间,曲美他嗪组MCT1表达量明显高于对照组,MCT4表达量无统计学意义。该结果和PCR结果相一致。4.MTT法检测细胞活力结果：显示曲美他嗪组细胞在缺血再灌注期间,细胞活力明显好于对照组。5.流式细胞仪检测细胞凋亡结果：显示曲美他嗪组细胞在缺血再灌注期间,细胞凋亡情况明显好于对照组。6Caspase-3活性定量检测结果：显示曲美他嗪组细胞在缺血再灌注期间Caspase-3活性明显低于对照组。[结论]曲美他嗪具有良好乳酸穿梭激动效益,对缺血再灌注损伤有明显保护作用。