前列腺癌（PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一,发病风险随着年龄的增加而增大。晚期转移性PCa患者的5年总体生存率只有30%。多西他赛是一种紫杉烷类抗有丝分裂的药物,是目前用于转移性去势抵抗性PCa化疗的1类推荐用药。然而在治疗过程中绝大多数患者不可避免的出现药物抵抗的现象。目前的研究认为多西他赛耐药主要与β微管蛋白亚型突变,药物流出泵的激活,雄激素受体,肿瘤微环境和自噬等有关,然而具体机制仍有待阐明。神经作为肿瘤微环境的重要组成部分,在肿瘤的发展中起到十分关键的作用。交感神经通过神经递质主要作用于β2肾上腺素受体（β2-AR）进行信号的传递。有研究显示β-AR阻滞剂普萘洛尔与阿霉素协同作用可以增加肉瘤细胞对多西他赛的敏感性,提示β2-AR可能与多西他赛耐药有关。β2-AR信号对PCa多西他赛耐药的影响目前未见文献报道。目前临床上对多西他赛耐药患者仍缺乏有效的治疗方法,因此研究多西他赛耐药的分子机制,寻找新的有效靶点及治疗方案成为目前亟需解决的难题。目的1.研究β2-AR在良性增生组织及不同病理特征的PCa组织,以及经多西他赛化疗前后PCa组织中的表达。2.探究β2-AR对PCa细胞对多西他赛敏感性及耐药性的影响。3.探讨β2-AR影响PCa细胞多西他赛耐药的作用机制。4.通过构建皮下成瘤模型,明确β-AR抑制剂与其他药物的联合使用对细胞多西他赛敏感性的影响。方法1.生物信息学分析及细胞检测分析。通过下载NCBI的GEO数据库的数据,分析了β2-AR在良性增生组织,不同病理特征的PCa组织以及多西他赛化疗前以及化疗后的PCa组织中的表达。通过Western blot,qPCR实验检测在经过多西他赛处理后PCa细胞中β2-AR的表达变化。通过Western blot,qPCR实验检测了 β-AR的各亚型在PCa细胞中的表达。2.细胞实验。通过CCK8实验检测β-AR抑制剂普萘洛尔对去势抵抗性PCa细胞多西他赛敏感性的影响,并检测了影响细胞多西他赛敏感性的途径。通过流式细胞术细胞凋亡检测,线粒体膜电位检测,以及Western blot实验检测了 β2-AR通过凋亡途径影响细胞多西他赛敏感性的分子机制。通过透射电镜我们对细胞内的自噬体进行了检测。通过慢病毒感染构建LC3B标记的稳转株,在共聚焦显微镜下观察普萘洛尔及多西他赛对细胞自噬流的影响。通过Western blot实验我们检测了葡萄糖血清饥饿对β2-AR表达的影响,并检测了 β2-AR激动剂或拮抗剂作用下细胞自噬相关蛋白的表达。通过感染慢病毒,构建shAtg5敲低的稳转株,检测了普萘洛尔和多西他赛诱导的细胞自噬的分子机制。通过剂量递增的方法我们构建了对多西他赛耐药的PCa细胞株。通过CCK8实验,平板克隆形成实验以及流式细胞术实验检测了亲本细胞和耐药细胞的耐药性。通过CCK8实验我们检测了亲本株和耐药株对普萘洛尔的敏感性。通过Western blot,qPCR实验我们检测了亲本株和耐药株中β2-AR的表达。通过Western blot实验,透射电镜我们检测了亲本株和耐药株中的自噬。通过CCK8我们进一步检测了普萘洛尔通过自噬对多西他赛敏感性及耐药性的影响。3.细胞机制研究。通过免疫共沉淀实验我们对普萘洛尔作用下的自噬关键因子BECN1与Vps34,BECN1与抗凋亡因子Bcl-2的相互作用进行了检测。通过Western blot实验我们对影响自噬和凋亡十分重要的p38MAPK和JNK信号通路的蛋白进行了检测。接着通过Western blot实验检测在p38MAPK抑制剂和JNK抑制剂作用对普萘洛尔及多西他赛对自噬蛋白和凋亡蛋白表达的影响。通过Western blot实验检测了普萘洛尔对自噬和凋亡平衡调控因子FOXO3a的蛋白合成及分解的影响。通过免疫荧光检测了普萘洛尔作用下细胞FOXO3a蛋白的表达与分布。4.体内实验。我们构建了皮下成瘤模型,并对裸鼠进行药物腹腔注射,检测了普萘洛尔,氯喹单独用药或联合用药对细胞体内生长的作用,并检测了普萘洛尔,氯喹分别与多西他赛联合用药对细胞体内生长的影响。通过进行免疫组化染色对瘤体内p-p38 MAPK,p-c-Jun,FOXO3a,Ki-67的表达进行了检测。结果1.在GEO数据库下载数据并进行分析,结果显示与良性增生组织相比,局限性PCa和晚期PCa中β2-AR的表达增高。而与局限性PCa相比,晚期去势抵抗性PCa中β2-AR的表达降低。此外在经过多西他赛化疗的患者PCa组织内的β2-AR表达出现了下调。通过对细胞进行多西他赛的处理,结果显示与对照组相比,多西他赛处理组的β2-AR的蛋白水平降低,mRNA水平反馈性增高。通过对β1-AR,β2-AR,β3-AR这三个亚型在不同PCa细胞系PC-3,22Rv1,DU145,LNCaP中的表达进行检测,结果显示在这些细胞中β2-AR是主要的β-AR表达亚型,PC-3,22Rv1,DU145 中 β2-AR 的表达高于 LNCaP 细胞。2.通过CCK8实验检测了抑制β2-AR对细胞多西他赛敏感性的影响,结果显示β-AR拮抗剂普萘洛尔增加细胞对多西他赛的敏感性,并且通过自噬和凋亡途径进行。普萘洛尔通过降低线粒体膜电位,激活凋亡级联信号进一步增加多西他赛诱导的凋亡。3.β-AR拮抗剂普萘洛尔促进PCa细胞自噬以及自噬流的进展。多西他赛及饥饿诱导自噬,下调β2-AR的蛋白表达。β2-AR激动剂异丙肾上腺素抑制自噬相关蛋白的表达,而普萘洛尔促进自噬相关蛋白的表达。异丙肾上腺素抑制自噬体的生成从而抑制自噬,而普萘洛尔促进自噬体的生成从而促进自噬。普萘洛尔通过Atg5/AMPK/mTOR信号通路进一步增加由多西他赛诱导的自噬。4.对耐药株和亲本株的耐药性进行检测,结果显示多西他赛耐药株的IC50远远大于亲本株,且耐药株在持续的多西他赛的作用下生长及存活未受明显影响,提示耐药株构建成功。与亲本株相比,耐药株对普萘洛尔的细胞增殖抑制作用更加敏感。耐药株中β2-AR的蛋白表达和mRNA表达均高于亲本株。与亲本株相比,PC-3耐药株中的自噬减少,22Rv1耐药株中的自噬增加。在亲本株中,与普萘洛尔+多西他赛组相比,普萘洛尔+多西他赛+自噬抑制剂组的细胞增殖活力显著下降。在耐药株中,与普萘洛尔+多西他赛组相比,普萘洛尔+多西他赛+自噬抑制剂组的细胞增殖活力显著下降。5.普萘洛尔降低BECN1与Bcl-2的相互作用,增加BECN1与Vps34的相互作用从而促进自噬。普萘洛尔作用下p38 MAPK,p-p38 MAPK,JNK,c-Jun,p-c-Jun s63,p-c-Jun s73,FOXO3a 的表达降低。与多西他赛组相比,普萘洛尔+多西他赛组的上述蛋白的表达进一步下调。与普萘洛尔组或普萘洛尔+多西他赛组相比,p38 MAPK抑制剂的加入进一步增加自噬蛋白LC3BⅡ和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,进一步降低凋亡蛋白BAX的表达。与普萘洛尔组或普萘洛尔+多西他赛组相比,JNK抑制剂的加入进一步降低LC3BⅡ的表达,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低BAX的表达。普萘洛尔下调FOXO3a的表达。6.与单独用药相比,普萘洛尔与氯喹联合使用进一步抑制肿瘤在体内的生长。此外普萘洛尔,氯喹分别与多西他赛联合使用进一步增强了多西他赛对细胞体内生长的抑制作用。免疫组化实验结果显示与对照组相比,普萘洛尔组,氯喹组,多西他赛组及联合用药组瘤体组织中p-p38,p-c-Jun,FOXO3a,Ki-67 的表达均出现了下调。结论1.β2-AR在PCa的发展过程中及多西他赛的抑癌过程中可能发挥重要的作用。2.抑制β2-AR的活性促进细胞自噬和凋亡从而增加细胞对多西他赛的敏感性,降低耐药性。3.多西他赛耐药株中β2-AR的表达较亲本株上调,β2-AR影响细胞对多西他赛耐药。4.β-AR拮抗剂通过减少BECN1和Bcl-2的相互作用,增加BECN1和Vps34的相互作用从而促进自噬。5.β-AR拮抗剂通过抑制p38 MAPK信号通路和JNK信号通路,促进细胞自噬和凋亡,从而影响多西他赛的药物敏感性。6.β-AR拮抗剂抑制调控自噬和凋亡稳态的关键因子FOXO3a的表达,从而影响自噬和凋亡的平衡。7.普萘洛尔与氯喹联合使用,或者分别与多西他赛联合使用能够进一步抑制细胞体内的生长。