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近年来，大量研究表明m6A的异常表达在许多生物过程中发挥重要的作用，如转录和翻译、核RNA输出以及RNA-蛋白相互作用等。ALKBH5作为m6A去甲基化酶，通过调节 mRNA 加工及代谢过程，从而参与肿瘤的发生发展。在本次研究中，通过 m6A 定量实验以及相关性分析发现结直肠癌患者癌组织与自体癌旁组织中的m6A整体水平与去甲基酶ALKBH5表达密切相关，进一步在结直肠癌临床样本中进行验证。通过构建 ALKBH5 过表达的 SW480、SW620 细胞株，在细胞水平探讨 ALKBH5对细胞生物学功能的影响。构建结肠炎-癌转化模型与 APCMin/+结直肠癌癌前病变小鼠模型，在动物水平检测 ALKBH5 的表达水平。在人群水平利用临床样本组织芯片及TCGA数据库，结合生物信息学分析，探讨ALKBH5与结直肠癌发生发展的关系。结果表明，ALKBH5在调控结直肠癌发生发展过程中发挥重要作用，这为进一步探索 m6A 修饰在结直肠癌中的作用及其分子机制提供重要理论依据和线索。
一、结直肠癌中RNA m6A修饰检测及相关功能基因筛选
1.收集 19 例结直肠癌患者癌组织与自体癌旁组织临床样本进行 m6A Dot Blot实验和m6A ELISA分析，探讨m6A整体水平是否存在差异。结果显示，与自体癌旁组织相比较，m6A在癌组织中表达水平明显增加。通过检测 m6A相关功能基因（甲基转移酶、去甲基酶）在结直肠癌中的表达水平，并与m6A水平进行相关性分析，根据相关性强度与 P 值选取功能基因，最终选择相关强度最大、P值较小的去甲基酶ALKBH5进行后续研究。
2.在南京与徐州两地收集结直肠癌患者癌组织与自体癌旁组织样本共192对。进一步扩大样本量对上述选取的去甲基酶ALKBH5进行验证，qRT-PCR结果显示，结直肠癌患者癌组织中ALKBH5 mRNA表达水平低于自体癌旁组织。通过 ROC 曲线分析可得 ALKBH5 具有作为辅助区分结直肠癌与癌旁组织的潜在价值。
二、ALKBH5对结直肠癌细胞生物学功能的影响
1.利用课题组成功构建的 ALKBH5 过表达慢病毒，使用慢病毒感染肿瘤细胞筛选稳定细胞株。运用Western Blot实验验证ALKBH5过表达是否成功。
2.对ALKBH5过表达的SW480、SW620细胞进行功能性实验，通过克隆形成实验检测其细胞增殖能力，运用Transwell方法检测侵袭和迁移能力改变，从而探讨ALKBH5对细胞生物学功能的影响。结果显示，ALKBH5过表达抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。
3.将ALKBH5过表达的SW480、SW620细胞注射入裸鼠皮下，构建裸鼠荷瘤模型。饲养 2 w，观察并记录肿瘤生长情况，利用荧光活体成像技术分析SW480、SW620 细胞裸鼠荷瘤能力。结果显示，与对照组相比，ALKBH5过表达显著抑制了肿瘤细胞的裸鼠荷瘤能力。
三、ALKBH5在小鼠结直肠癌模型中的表达水平
1.通过构建结肠炎-癌转化模型，期间观察并检测小鼠生长体征变化情况。构建完毕后收取小鼠结肠组织，记录模型小鼠结肠长度与成瘤情况，通过qRT-PCR实验检测结肠癌组织中 ALKBH5 表达水平。结果表明，结肠炎-癌转化模型小鼠结肠癌组织中ALKBH5 mRNA表达水平较对照组明显降低，且具有统计学差异。
2.构建APCMin/+结直肠癌癌前病变小鼠模型，期间观察并检测小鼠生长体征变化情况。构建完毕后收取小鼠结肠组织，记录APCMin/＋小鼠结肠长度与成瘤情况，通过qRT-PCR 实验检测结肠癌组织中ALKBH5表达水平。结果表明，APCMin/＋小鼠结肠癌组织中 ALKBH5 mRNA 表达水平较对照组明显降低，且具有统计学差异。
四、ALKBH5在人群水平与结直肠癌发生发展的作用机制研究
1.通过构建结直肠癌患者癌及癌旁组织组织芯片（TMA），采用免疫组化技术检测TMA中ALKBH5蛋白表达水平。结果表明，结直肠癌患者癌组织中ALKBH5蛋白表达水平低于癌旁组织，且评分差异具有统计学意义。对患者样本临床信息进行统计分析发现，ALKBH5 蛋白表达水平与结直肠癌患者肿瘤分期、是否出现远端转移或淋巴结转移存在密切联系。Kaplan-Meier分析结果表明，与ALKBH5低表达的结直肠癌患者相比，高表达的结直肠癌患者预后较好。且多因素 COX回归结果表明ALKBH5 是能够影响结直肠癌患者生存时间的重要因素。
2.通过对 TCGA 数据库中结直肠癌患者测序数据进行分析，从而探究ALKBH5 在结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的表达情况。结合患者样本临床信息，探讨ALKBH5表达水平是否与结直肠癌各临床指标具有相关性。结果显示，ALKBH5在结直肠癌组织中表达要低于癌旁组织；ROC曲线分析可得ALKBH5具有作为辅助区分结直肠癌与癌旁组织的潜在价值。且高年龄组（Age≥67岁）患者中，ALKBH5表达水平与结直肠癌患者肿瘤分期、是否出现远端转移或淋巴结转移存在密切联系。Kaplan-Meier分析结果表明，相对于ALKBH5高表达的结直肠癌患者，ALKBH5低表达的结直肠癌患者生存时间降低。
综上所述，我们发现在结直肠癌患者癌组织中m6A相关功能基因ALKBH5表达下调，并在细胞、动物和人群水平进行了验证。ALKBH5过表达可显著抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。ALKBH5表达水平与结直肠癌患者总生存期降低存在明显相关性，且具有作为结直肠癌与癌旁组织辅助诊断与治疗干预靶点的潜在价值。这也为进一步探索 m6A 修饰在结直肠癌中的作用及其分子机制提供重要理论依据和线索。
一、结直肠癌中RNA m6A修饰检测及相关功能基因筛选
1.收集 19 例结直肠癌患者癌组织与自体癌旁组织临床样本进行 m6A Dot Blot实验和m6A ELISA分析，探讨m6A整体水平是否存在差异。结果显示，与自体癌旁组织相比较，m6A在癌组织中表达水平明显增加。通过检测 m6A相关功能基因（甲基转移酶、去甲基酶）在结直肠癌中的表达水平，并与m6A水平进行相关性分析，根据相关性强度与 P 值选取功能基因，最终选择相关强度最大、P值较小的去甲基酶ALKBH5进行后续研究。
2.在南京与徐州两地收集结直肠癌患者癌组织与自体癌旁组织样本共192对。进一步扩大样本量对上述选取的去甲基酶ALKBH5进行验证，qRT-PCR结果显示，结直肠癌患者癌组织中ALKBH5 mRNA表达水平低于自体癌旁组织。通过 ROC 曲线分析可得 ALKBH5 具有作为辅助区分结直肠癌与癌旁组织的潜在价值。
二、ALKBH5对结直肠癌细胞生物学功能的影响
1.利用课题组成功构建的 ALKBH5 过表达慢病毒，使用慢病毒感染肿瘤细胞筛选稳定细胞株。运用Western Blot实验验证ALKBH5过表达是否成功。
2.对ALKBH5过表达的SW480、SW620细胞进行功能性实验，通过克隆形成实验检测其细胞增殖能力，运用Transwell方法检测侵袭和迁移能力改变，从而探讨ALKBH5对细胞生物学功能的影响。结果显示，ALKBH5过表达抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。
3.将ALKBH5过表达的SW480、SW620细胞注射入裸鼠皮下，构建裸鼠荷瘤模型。饲养 2 w，观察并记录肿瘤生长情况，利用荧光活体成像技术分析SW480、SW620 细胞裸鼠荷瘤能力。结果显示，与对照组相比，ALKBH5过表达显著抑制了肿瘤细胞的裸鼠荷瘤能力。
三、ALKBH5在小鼠结直肠癌模型中的表达水平
1.通过构建结肠炎-癌转化模型，期间观察并检测小鼠生长体征变化情况。构建完毕后收取小鼠结肠组织，记录模型小鼠结肠长度与成瘤情况，通过qRT-PCR实验检测结肠癌组织中 ALKBH5 表达水平。结果表明，结肠炎-癌转化模型小鼠结肠癌组织中ALKBH5 mRNA表达水平较对照组明显降低，且具有统计学差异。
2.构建APCMin/+结直肠癌癌前病变小鼠模型，期间观察并检测小鼠生长体征变化情况。构建完毕后收取小鼠结肠组织，记录APCMin/＋小鼠结肠长度与成瘤情况，通过qRT-PCR 实验检测结肠癌组织中ALKBH5表达水平。结果表明，APCMin/＋小鼠结肠癌组织中 ALKBH5 mRNA 表达水平较对照组明显降低，且具有统计学差异。
四、ALKBH5在人群水平与结直肠癌发生发展的作用机制研究
1.通过构建结直肠癌患者癌及癌旁组织组织芯片（TMA），采用免疫组化技术检测TMA中ALKBH5蛋白表达水平。结果表明，结直肠癌患者癌组织中ALKBH5蛋白表达水平低于癌旁组织，且评分差异具有统计学意义。对患者样本临床信息进行统计分析发现，ALKBH5 蛋白表达水平与结直肠癌患者肿瘤分期、是否出现远端转移或淋巴结转移存在密切联系。Kaplan-Meier分析结果表明，与ALKBH5低表达的结直肠癌患者相比，高表达的结直肠癌患者预后较好。且多因素 COX回归结果表明ALKBH5 是能够影响结直肠癌患者生存时间的重要因素。
2.通过对 TCGA 数据库中结直肠癌患者测序数据进行分析，从而探究ALKBH5 在结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的表达情况。结合患者样本临床信息，探讨ALKBH5表达水平是否与结直肠癌各临床指标具有相关性。结果显示，ALKBH5在结直肠癌组织中表达要低于癌旁组织；ROC曲线分析可得ALKBH5具有作为辅助区分结直肠癌与癌旁组织的潜在价值。且高年龄组（Age≥67岁）患者中，ALKBH5表达水平与结直肠癌患者肿瘤分期、是否出现远端转移或淋巴结转移存在密切联系。Kaplan-Meier分析结果表明，相对于ALKBH5高表达的结直肠癌患者，ALKBH5低表达的结直肠癌患者生存时间降低。
综上所述，我们发现在结直肠癌患者癌组织中m6A相关功能基因ALKBH5表达下调，并在细胞、动物和人群水平进行了验证。ALKBH5过表达可显著抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。ALKBH5表达水平与结直肠癌患者总生存期降低存在明显相关性，且具有作为结直肠癌与癌旁组织辅助诊断与治疗干预靶点的潜在价值。这也为进一步探索 m6A 修饰在结直肠癌中的作用及其分子机制提供重要理论依据和线索。