论文部分内容阅读
吡咯里西啶生物碱（Pyrrolizidine alkaloid,PAs）是一种常见的植物次生代谢产物,具有严重的肝毒性、肺毒性、肾毒性、心肌毒性、神经毒性、致癌性和致畸性。当人类长期摄入含有PAs的草药或植物制剂后导致肝窦阻塞综合征（hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS）的发生,目前临床上缺少治疗HSOS的有效方案,因此全面评估PAs的肝毒性对于HSOS病人的治疗至关重要。促黑激素（Intermedine,Im）是紫草（Comfrey）中含量较高的PA,属于倒千里光碱型单酯,结构中的不饱和双键具有活性,代谢活化后对肝细胞具有毒性作用。目前对于Im肝细胞毒性和毒理的研究极少,并且没有关于PAs联合细胞毒性和毒性机制的研究。本文研究8种PAs对4种动物细胞的毒性作用,利用细胞毒性评价的方法探究Im对肝细胞的毒性和作用机制。进一步利用细胞毒性评价的方法探究Im和石松胺（lycopsamine,La）的联合肝细胞毒性及其毒性机制。本文为PAs的安全性评价和风险评估提供基础数据,主要研究结果如下:1、揭示了8种PAs对4种动物细胞的细胞毒性:通过CCK-8实验检测促黑激素、促黑激素氮氧化物、石松胺、石松胺氮氧化物、倒千里光碱、倒千里光碱氮氧化物、千里光宁碱和千里光宁碱氮氧化物对小鼠原代肝细胞、人肝细胞（Hep D）、小鼠肝癌细胞22(H22)和人肝癌细胞（Hep G2）的细胞毒性。结果证实8种PAs对4种细胞均有显著的增殖抑制效果,其中促黑激素对小鼠原代肝细胞、人肝细胞（Hep D）、小鼠肝癌细胞22(H22)和人肝癌细胞（Hep G2）的半数抑制浓度(IC50)分别为49.4μg/m L、71.7μg/m L、48.5μg/m L和56.6μg/m L,其他7种PAs对4种细胞的IC50值均在30-90μg/m L范围内。2、明确了Im抑制Hep D细胞的增殖的原因。设置0、20、50、75、100μg/m L的处理浓度,处理时间为24小时。根据观察细胞形态、细胞克隆单位形成实验、单细胞层的伤口愈合实验和凋亡细胞数量检测等实验的结果得出Im通过抑制Hep D细胞定殖和迁移的能力来诱导细胞凋亡。3、阐明了Im对人肝细胞（Hep D）增殖抑制的作用机制。借助活性氧荧光探针DCFH-DA、线粒体膜电位探针JC-1和生物透射电子显微镜（TEM）证明Im通过激活细胞内氧化应激、降低线粒体膜电位、破坏线粒体结构诱导Hep D细胞死亡。蛋白质印迹实验结果证实Im作用于Hep D细胞后触发Bax表达在线粒体膜上形成孔道,将线粒体中的细胞色素c（Cyt c）释放到胞浆中,Cyt c与凋亡酶激活因子（Apaf-1）结合,导致caspase-9磷酸化,从而激活caspase-3通路引发细胞凋亡。4、证实了多种PAs混合的肝细胞毒性大于单一PA的肝细胞毒性。体外CCK-8实验证实,与单一一种PA相比较,低浓度（5μg/m L）的促黑激素、促黑激素氮氧化物、石松胺、石松胺氮氧化物、倒千里光碱、倒千里光碱氮氧化物、千里光宁碱和千里光宁碱氮氧化物混合物对Hep D细胞活力具有显著的抑制作用。说明低剂量的PAs混合物的细胞毒性较高,具有很大的安全风险。5、证实了Im和La复合诱导的肝细胞毒性大于Im诱导的肝细胞毒性,并通过线粒体凋亡过程中的caspase-3通路和内质网应激相关信号通路PERK/e IF2α/ATF-4/CHOP通路诱导的肝细胞凋亡。根据CCK-8实验结果,与Im或La相比较,Im和La混合物抑制Hep D细胞增殖的能力更强。在体外,根据细胞形态的改变、细胞克隆单位形成、伤口愈合和Annexin V/PI双染实验和流式细胞分析实验定性和定量地证实Im和La混合物通过抑制细胞增殖、定殖和迁移的能力而诱导Hep D细胞凋亡。进一步采用细胞内活性氧荧光探针DCFH-DA、线粒体膜电位荧光探针JC-1、线粒体定位检测探针Mito-Tracker Red CMXRos、钙离子荧光探针Fluo-4AM和内质网定位探针ER-Tracker Green证明Im和La混合物启动细胞内氧化应激、线粒体膜电位下降、线粒体功能紊乱、钙离子失衡和内质网应激诱导细胞凋亡。同时,生物电子显微镜图像表明Im和La混合物严重损伤线粒体结构,蛋白质印迹实验结果证实线粒体凋亡过程中的caspase-3通路和内质网应激相关信号通路PERK/e IF2α/ATF-4/CHOP通路都参与了Im和La混合物诱导的肝细胞凋亡。综上所述,单酯型PAs（Im）能够诱导肝细胞毒性,并通过触发肝细胞内氧化应激活性氧爆发和线粒体凋亡通路诱导肝细胞凋亡。此外,两种单酯PAs（Im和La）复合能够显著诱导肝细胞毒性,并通过触发细胞内内质网应激、活性氧爆发和线粒体凋亡通路诱导肝细胞凋亡。