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目的:自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是一种由未知病因引起的免疫介导的炎症性疾病。目前临床治疗仍然以对症支持治疗为主,酌情使用激素,后期考虑肝脏移植治疗。前者副作用明显,后者供体时而受到限制。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)来源的外泌体(exosome,Exo)含有丰富的生物活性物质,具有修复特定损伤细胞和组织的巨大潜力,可用于AIH的治疗。本研究旨在利用间充质干细胞分泌的外泌体设计药物传递系统,用于装载激素药物地塞米松(Dexamethasone,DEX),进而被装载到外泌体中,即构建装载有地塞米松的间充质干细胞外泌体Exo@DEX。同时,在细胞和动物实验两方面,观察Exo@DEX的细胞表型特性、Exo@DEX肝脏靶向性,以及Exo@DEX对自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)的治疗作用与安全性评价。方法:(1)利用全骨髓法提取小鼠骨髓间充质干细胞,培养至第3代后使用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)对细胞进行表面蛋白鉴定。收集细胞上清,利用超速离心法分离提纯Exo,利用脉冲式超声法将小分子药物DEX装载入Exo中,构建出载药外泌体Exo@DEX。利用Western Blot鉴定Exo和Exo@DEX表面的外泌体标志蛋白CD9和CD63,生物透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)观察Exo和Exo@DEX的形貌,纳米颗粒追踪和动态光散射分析Exo和Exo@DEX的粒径和电位,高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)法检测Exo@DEX中DEX的含量。(2)在细胞水平,利用CCK-8法检测Exo@DEX对RAW264.7与L02细胞活性的影响;利用凋亡试剂盒检测Exo@DEX对细胞凋亡的影响;利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪在不同时间点检测细胞对Exo@DEX的摄取情况。(3)在动物水平,利用小动物成像系统考察Exo与Exo@DEX对肝脏的靶向功能、在各脏器的分布以及在肝脏中的滞留时间,利用流式细胞术和冰冻切片验证Exo与Exo@DEX在肝脏中的富集;利用刀豆蛋白A构建小鼠自身免疫性肝炎模型,8 h后获取小鼠血清检测转氨酶水平,取肝脏组织制备H&E切片,并获得肝脏组织研磨液进行炎症因子的检测;健康小鼠给予Exo@DEX,获取各组织器官H&E切片,进行血常规和血生化分析,考察药物的生物安全性。结果:(1)原代培养的间充质干细胞纯度大于95%;Exo和Exo@DEX均表达CD9和CD63,透射电镜均呈现为类圆形的囊泡样结构,粒径分布在100 nm左右,Exo的电位约为-10 mV,Exo@DEX的电位约为-6 mV;高效液相色谱检测到DEX的特征峰。(2)与DEX组相比,Exo@DEX降低了巨噬细胞的活性,促进其凋亡的发生,而对L02细胞没有明显影响;将Exo@DEX与细胞共孵育后,RAW264.7与L02细胞均能够摄取纳米颗粒,呈现时间依赖性,且RAW264.7摄取更多的纳米颗粒。(3)Exo和Exo@DEX均能够靶向肝脏,在2 h即可达到高峰,且能够滞留24 h,装载药物对外泌体的脏器分布和滞留时间没有明显影响;在AIH模型中,Exo@DEX能够有效减小肝脏的损伤,降低肝脏转氨酶和炎症因子水平;在药物安全性实验中,Exo@DEX对各组织器官没有明显毒性,血常规和血生化指标没有发生明显改变。结论:(1)成功构建了负载地塞米松的间充质干细胞外泌体Exo@DEX(2)初步获得了Exo@DEX治疗自身免疫性肝炎的治疗效果(3)研发了一种具有生物安全性的肝脏靶向的药物递送体系