【摘 要】
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目的:通过建立体外氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型,模拟缺氧缺血（hypoxia-ischemia,H-I）性神经系统疾病。探讨骨髓间充质干细胞外泌体（bone marrow mesenchymal stem cells exosome,BMSCs-Exo）内miR-199a-5p对神经干细胞（neural stem
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81971152）；
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目的:通过建立体外氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型,模拟缺氧缺血（hypoxia-ischemia,H-I）性神经系统疾病。探讨骨髓间充质干细胞外泌体（bone marrow mesenchymal stem cells exosome,BMSCs-Exo）内miR-199a-5p对神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的保护作用及机制。为神经系统疾病的治疗寻求新的方法。研究方法:（1）提取SD大鼠胎鼠海马区及一日龄大鼠脊髓原代神经干细胞（neural stem cells,NSCs）,免疫荧光法鉴定NSCs。将骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）培养至P4-P6更换为无外泌体（exosome,Exo）血清,收集细胞上清,每48小时给细胞换液,用差速离心法提取细胞上清中的Exo。Western Blot方法测定Exo标记蛋白CD9、CD63,透射电镜下观察Exo大小及形态,Exo纳米粒径跟踪分析（NTA）测定所提取囊泡粒径分布。将Exo用荧光染料Di O标记并与NSCs共培养。（2）建立OGD/R模型:通过CCK-8法建立OGD/R组与Normal组OGD4h,R24h,R48h,R72h,R96h,R120h细胞增殖曲线。将提取的P2代NSCs分为四组:正常组（Normal）、氧糖剥夺/复氧组（OGD/R）、外泌体组（Exo）、miR-199a-5p过表达外泌体组（miR-199a-5p-Exo）,通过OGD4h,R48h建立OGD/R模型,CCK-8法检测各组活细胞数目,免疫荧光法检测各组NSCs标记物nestin表达量,Edu增殖实验检测各组增殖细胞数量。q RT-PCR法检测各组miR-199a-5p表达量。双荧光素酶实验验证miR-199a-5p和GSK-3β野生型或突变型的3’UTR区结合后双荧光素酶活性,Western Blot法检测GSK-3β和β-catenin表达量。结果:（1）成功提取SD大鼠胎鼠海马区和一日龄大鼠脊髓NSCs,显微镜下成明显悬浮球形,免疫荧光结果显示表达NSCs标记物Nestin。BMSCs-Exo电镜下成茶托状囊泡结构,NTA结果显示平均粒径为130nm,Western Blot结果显示表达Exo表面标记物CD9、CD63。显微镜下可见BMSCs-Exo被NSCs吞噬。（2）成功建立NSCs的OGD/R模型,CCK-8结果显示OGD4h,复氧24h,细胞存活率下降40%-60%,复氧24h-48h细胞增殖最多。免疫荧光和CCK-8结果显示Exo组比OGD/R组细胞存活率高,过表达miR-199a-5p-Exo组最高。Edu实验结果证实Exo促进OGD/R后Edu表达,miR-199a-Exo组Edu表达多于Exo组。PCR结果显示Exo组miR-199a-5p表达高于OGD/R组,miR-199a-5p-Exo组miR-199a-5p表达量最高。双荧光素酶结果证实GSK-3β是miR-199a-5p的直接靶点。Western Blot结果显示,Exo抑制GSK-3β表达,增加β-catenin表达,miR-199a-5p-Exo组GSK-3β表达最低,β-catenin表达最多。结论:（1）SD大鼠胎鼠海马区NSCs多于一日龄大鼠脊髓NSCs,且细胞活力更好,差速离心法提取的细胞囊泡为Exo。（2）BMSCs-Exo对OGD/R后NSCs具有保护作用,过表达miR-199a-5p的BMSCs-Exo比Exo促进NSCs增殖作用更强。（3）miR-199a-5p可以抑制Wnt通路中GSK-3β表达,增加β-catenin表达,从而促进OGD/R后NSCs增殖。
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