【摘 要】
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该研究通过农杆菌Ti质粒介导的遗传转化,首次将含模式基因(NPTⅡ+GUS基因)的载体PBⅡ21导入泡桐,并对影响转化及选择再生的一系列因子进行优化,创建了泡桐的遗传转化系统.结
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该研究通过农杆菌Ti质粒介导的遗传转化,首次将含模式基因(NPTⅡ+GUS基因)的载体PBⅡ21导入泡桐,并对影响转化及选择再生的一系列因子进行优化,创建了泡桐的遗传转化系统.结果表明,外植体类型、菌液浓度、共培养时间、Ca<2+>及酚类物质均影响转化频率,卡那霉素(Kan)的选择压以羧苄青霉素(Carb)的作用对于选择再生至关重要.优化后的系统为:以泡桐完整叶片为外植体,侵染转化的菌液浓度OD<,600>值控制在0.1~0.2之间,经20m mol/L Ca<2+>处理,最佳共培养时间为6天;在10mg/L Kan+250 mg/L Carb的选择压下培养几天,随后在仅含Kan的选择压下继续培养,直至抗性芽的再生.通过此遗传转化系统,获得了抗Kan的泡桐芽,转化频率可达80%.组织化学法检测表明,GUS报告基因不仅在侵染的叶片中得到了短暂表达,而且在抗性愈伤组织和抗性芽中得到了稳定表达,其中在维管束组织中表达最强.该遗传转化系统的创建为泡桐的基因工程及对植原体病害的分子防治奠定了基础.此外,该研究还进一步完善优化了泡桐的组培离体再生系统.实验发现所有外值体中泡桐完整叶片的再生效率最高,6mg/L或8mg/L 6-BA对诱导完整叶片的再生芽最合适,其诱导的再生频率高达88.4%.1.5mg/L的亚精胺(Spd)或5mg/L精胺(Spm)可促进芽的分化,而NAA不利于芽的分化.对愈伤组织诱导,一定浓度的6-BA与NAA配合较单一的NAA效果好.泡桐完整叶片的高效再生系统为遗传转化提供了保证.
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