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自然流产是最常见的妊娠并发症，大约15-25％的临床可见妊娠以自然流产终止，严重危害女性身心健康。根据中医“肾主生殖”的理论，我们运用补肾益气方治疗自然流产数千例，保胎疗效确切。系列临床研究和动物实验表明补肾益气方调节生殖内分泌．免疫网络平衡。胎盘作为妊娠期特殊的内分泌和免疫器官，在维持妊娠中起关键作用，但补肾益气方对胎盘发育及功能的作用尚不明确。补肾益气方是中药复方，成分非常复杂，但只有被吸收入血的成分才能产生作用，因而给药后的血清才是真正起作用的“制剂”，血清中含有的成分才是补肾益气方的体内直接作用物质。人胎盘的功能和结构单位是绒毛膜绒毛，细胞滋养层细胞是绒毛膜绒毛发育的干细胞，因此本实验用血清药理学方法探讨补肾益气方对正常早孕期人滋养层细胞生长与凋亡特性的调节。 第一部分 补肾益气方对正常早孕期人滋养层细胞生长特性的调节 (一)正常早孕期人滋养层细胞的分化功能及分离方法 【目的】用不同方法分离正常早孕期人滋养层细胞，分析其分化功能。 【方法】用不同的消化方法分离正常早孕期人滋养层细胞，分别在体外培养24h，用相差显微镜观察活细胞形态，用光镜观察Giemsa染色后的细胞形态，用免疫细胞化学法鉴定其分子表达特征，用扫描电镜观察细胞表面超微结构，并用Transwell分析绒毛外滋养层细胞的侵袭能力。 【结果】(1)采用低浓度胰酶、一次性、无振荡、铺Matrigel或鼠尾胶的方法获得绒毛外滋养层细胞，形态特征是：细胞核大、圆，核仁多，胞浆少，细胞互相聚集但不聚合；细胞特异表达细胞角蛋白7，不表达波形蛋白，能够在matrigel中侵袭、迁移，穿过transwell，具有高度增殖活性和侵袭能力；(2)采用高浓度胰酶、长时间连续消化法分离得到绒毛滋养层细胞，形态特征是：细胞核相对小，胞浆丰富，延伸，细胞表面有微绒毛样突起结构，具有高度融合特性，融合成多核的合体滋养层细胞不再增殖，但具有内分泌活性，胞浆表达丰富的hCG-β，不表达波形蛋白；(3)采用低浓度胰酶连续消化法、铺mattigel或鼠尾胶的方法获得的细胞包含绒毛外滋养层细胞和绒毛滋养层细胞，其共性是表达细复口大学博卜研究生毕业论文f卜肾益气方对正常早孕期人滋养层细胞生长‘J凋亡特性的调竹胞总角蛋白，不表达波形蛋白。 【结论】利用不同的分离方法可有效、经济地获得具有不同分化功能的旱孕期人滋养层细胞，无论是具有侵袭功能的绒毛外滋养层细胞，还是支持胚胎生长的绒毛滋养层细胞，都在胎盘结构的建立和功能的发挥过程中起着关键的作用。(二)补肾益气方对正常早孕期人滋养层细胞生长特性的调节 【目的】用血清药理学方法探讨补肾益气方对正常早孕期人滋养层细胞生长特性的调节作用。 【方法】提取连续三天口服补肾益气方的大鼠血清，分别以5%、10%、20%血清浓度加入到原代分离培养的滋养层细胞中，用相同方法提取口服生理盐水的大鼠血清作为空白血清对照。不同的处理因素干预48h及72h后用扫描电镜观察细胞表面超微结构的变化;MTT比色法检测处理24h、48h、72h前后滋养层细胞活力变化;用流式细胞仪观察处理24h及48h后滋养层细胞周期分布变化;Transwell侵袭实验检测处理72h后绒毛外滋养层细胞侵袭力的变化。 [结果1不同浓度含药血清培养滋养层细胞相应时间后，(l)扫描电镜观察到细胞表面微绒毛丰富、延长;(2)细胞活力随含药血清浓度升高而增加，呈明显的剂量依赖性;(3) DNA直方图上表现为亚二倍体细胞数减少，S期细胞数增多;(4)侵袭实验结果证实含药血清培养组穿过8林m微孔膜的细胞数明显高于空白对照组。 【结论】补肾益气方调节正常早孕期人滋养层细胞的分化能力，可能促进细胞融合，利于hCG一p合成;提高滋养层细胞活力，抑制DNA亚二倍体峰形成，增加S期细胞数目，促进早孕期人滋养层细胞生长;增强绒毛外滋养层细胞的侵袭活性，利于胚胎着床。第二部分补肾益气方对正常早孕期人滋养层细胞凋亡特性的调节(一)补肾益气方对下闪F一a/l FN一Y诱导的人滋养层细胞凋亡的调节作用 【目的】的调节作用。 【方法】理因素;(2)探讨补肾益气方对TNF一。/I FN一Y诱导的早孕期人滋养层细胞凋亡实验随机分为六组。(l)正常对照组(以下简称正常):无任何处凋亡模型组(以下简称T/I):10ng/mlT’-NF一a和100川mnFN一Y诱一导滋复日大学博l一研究生毕业论文补肾益气方对正常旱孕期人滋养层细胞生长‘了调亡特性的调竹养层细胞凋亡;(3)空白血清对照组(以卜简称T/I+空白):凋亡模型加入空自大鼠血清;(4)5%含药血清干预凋一亡模型组(以下简称T/卜5%):凋亡模型加入5%含药血清;(5)10%含药血清干预凋亡模型组(以下简称T/l+lO%):凋亡模型加入10%含药血清;(6)20%含药血清干预凋亡模型组(以下简称T/I+2O%):凋亡模型加入20%含药血清。不同处理因素干预滋养层细胞24h及48h后用MTT比色法检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞亚二倍体峰、原位缺口末端标记法(T UNEL染色)检测凋亡细胞发生率、casPase一3活性检测试剂盒检测casPase一3酶活性。