【摘 要】
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丙氨酸脱氢酶（ADH;EC.1.4.1.1）属于氧化还原酶类,该酶可以利用NAD（P）+和NAD（P）H作为辅酶,催化丙氨酸和丙酮酸之间的相互转化。它在细菌、真菌和植物中普遍存在,是糖代谢和氨基酸代谢过程中非常重要的酶,在食品、医药、生物技术领域已被广泛应用。本研究对致病菌Helicobacter aurati的基因序列进行分析,发现它存在两个潜在的ADH蛋白序列,我们将其命名为HaADH1和Ha
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丙氨酸脱氢酶（ADH;EC.1.4.1.1）属于氧化还原酶类,该酶可以利用NAD（P）+和NAD（P）H作为辅酶,催化丙氨酸和丙酮酸之间的相互转化。它在细菌、真菌和植物中普遍存在,是糖代谢和氨基酸代谢过程中非常重要的酶,在食品、医药、生物技术领域已被广泛应用。本研究对致病菌Helicobacter aurati的基因序列进行分析,发现它存在两个潜在的ADH蛋白序列,我们将其命名为HaADH1和HaADH2,采用不同拷贝数的质粒在分子伴侣蛋白的协助下促进其可溶性表达,以丙酮酸为底物,发现HaADH1能够催化丙氨酸和丙酮酸之间的相互转化,但HaADH2对丙氨酸和丙酮酸都没有显示出催化活力。对HaADH1的酶学性质进行研究,得到其最适温度为55℃,还原反应的最适p H为8.0,在p H 5.0的时候只有最大活力的17%,但其比酶活却有45.6 U·mg-1,氧化反应的最适p H为9.0。所有测定的金属离子对HaADH1都有不同程度的抑制,说明这个酶属于非金属依赖型的酶。在还原反应中,HaADH1对丙酮酸表现出最高的底物亲和力(Km=0.56 m M,kcat/Km=364.1 s-1·m M-1),与丙酮酸相比,HaADH1对草酰乙酸,3-氟丙酮酸,α-酮戊二酸,乙醛酸的相对活性分别为93.3%,5.6%,2.6%,2.5%,而氧化反应只对丙氨酸具有氧化活性。对丙酮酸、3-氟丙酮酸、丙氨酸、NH4+的Km值分别为0.6、15.0、2.3、31.0 m M,kcat/Km值分别为364.1、0.6、8.1、7.1 s-1·m M-1。系统发育树分析表明HaADH1与他人已报道的丙氨酸脱氢酶的序列相似性较低,说明这是一种新型的丙氨酸脱氢酶。将HaADH1与葡萄糖脱氢酶连接到p RSFDuet-1载体上,转化进大肠杆菌中进行共表达,通过全细胞催化50 m M的3-氟丙酮酸,12 h的转化率达到98.3%。与以往已经报道的丙氨酸脱氢酶进行序列比对,发现Arg 15,Lys 74,His 95,Asp 268这四个位点是非常保守的,对这四个保守氨基酸进行定点突变,发现突变体均丧失了活性,并且有文献报道这四个位点是催化中心,因此推测在HaADH1中这四个位点可能也是催化中心。利用同源建模得到的模型结构对底物周围5（?）范围内的氨基酸进行丙氨酸扫描,发现只有Y93A对丙酮酸的催化活力上升,上升为野生型（Wild type,WT）的106%。对丙氨酸侧链甲基所在疏水口袋的三个氨基酸Tyr 93、Leu 128、Met 131进行饱和突变,发现Y93R和Y93K对丙酮酸的还原反应酶活力分别上升为野生型的164.5%和155.0%,半衰期由野生型的2.5 h分别提高到3 h和3.4 h,对3-氟丙酮酸的kcat/Km值由野生型的0.6 s-1·m M-1分别提升至2.5和1.8 s-1·m M-1。
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