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目的本研究拟在课题组前期研究的基础上,从理论探讨和动物实验两方面展开。理论研究部分梳理中西医学对绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,PMOP）的认识,探讨“痰浊”作为PMOP致病因素的理论依据,为后续的实验研究提供理论支撑。实验研究部分基于“痰浊”与脂代谢紊乱、脂代谢紊乱与PMOP发病的高度相关性,以瘦素（Leptin,LPN）对脂/骨代谢的中枢和外周调控作用为切入点,通过去除大鼠双侧卵巢（Ovariectomized,OVX）建立PMOP模型,观察补肾化痰方对模型大鼠脂/骨代谢的干预作用,以及该方对LPN-下丘脑神经肽Y（Neuropeptide Y,NPY）轴、骨脂平衡稳态的影响及细胞分子机制,以期初步阐明补肾化痰方减少绝经后骨丢失、改善脂代谢的中枢和外周机制,为“从痰论治PMOP”提供实验依据。方法1.理论研究通过古籍梳理、文献检索等研究方法,凝练总结古今医家对PMOP的临床表现、病因病机及防治等方面的认识,从中外大量的基础及临床研究、流行病学调查中归纳总结雌激素缺乏导致的脂/骨代谢紊乱在PMOP发病中的作用,以及“痰浊”与脂代谢紊乱、PMOP发病的密切关系,为“从痰论治PMOP”奠定理论基础,也为实验研究的开展提供理论依据。2.实验研究6月龄SPF级未孕雌性SD大鼠75只,按照随机数字表法分为假手术组、模型组、阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组,每组15只。假手术组大鼠切除卵巢周围同等质量的脂肪组织,其余4组大鼠均切除双侧卵巢,建立PMOP模型。术后第5周开始灌胃给药8周:补肾化痰组9.4 g/kg、阿托伐他汀组0.92mg/kg、利维爱组0.23mg/kg,模型组和假手术组2ml生理盐水,1次/d。实验一:比较各组大鼠体重增长情况;采用苏木精-伊红（Hematoxylin-eo sin staining,HE）染色观察各组大鼠股骨组织的病理形态改变,测量骨髓脂肪组织（Bone marrow adipose tissue,BMAT）相对面积;微计算机断层扫描技术（Micro computed tomography,Micro CT）检测各组大鼠胫骨骨量、骨微结构及全身脂肪含量;运用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组大鼠血清LPN水平。实验二:采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测各组大鼠下丘脑组织LPN、瘦素受体（Leptin receptor,OBR）、NPY及其Y2受体mRNA相对表达量;免疫印迹试验（Western-Blot,WB）、免疫组化法检测各组大鼠下丘脑组织LPN、OBR、NPY及其Y2受体蛋白表达及定位情况。实验三:采用RT-PCR检测各组大鼠下丘脑组织PI3K/Akt/FoxO1信号通路基因转录水平;运用WB检测各组大鼠下丘脑组织PI3K/Akt/FoxO1信号通路蛋白表达及其磷酸化水平。实验四:采用RT-PCR、WB检测各组大鼠股骨组织Runx2、PPARγ基因转录及蛋白表达水平;以RT-PCR、WB、免疫组化法检测各组大鼠股骨组织LPN、OBR基因转录和蛋白表达及定位情况。实验五:采用RT-PCR检测各组大鼠股骨组织ERK1/2、P38MAPK mRNA相对表达量;运用WB检测各组大鼠股骨组织ERK1/2、P38MAPK蛋白表达及其磷酸化水平。结果1.理论研究肾为水脏,肾虚可生痰,绝经后女性肾精亏虚,是PMOP的病机根本,也为痰浊内生提供了的病理基础。骨代谢和脂代谢之间存在着千丝万缕的联系,骨骼和脂肪的调节是相关和相互依赖的。女性绝经后雌激素缺乏,导致脂骨代谢平衡稳态被破坏,在PMOP的发生发展中具有重要作用。痰证患者往往出现血脂异常,而高脂血症等脂代谢相关疾病也以“痰浊证”最为常见,且治疗这类疾病常常从“痰湿”着手。此外,许多化痰中药具有降脂作用,“痰湿质”是肥胖等脂代谢相关疾病与PMOP共同的最常见的致病特质之一。在治疗方面,随着PMOP病情的好转,脂代谢紊乱也得到不同程度纠正,而他汀类降脂药物也被证实具有抗骨质疏松作用。这些充分证明“痰浊”与脂代谢紊乱和PMOP密切相关。所以,“痰浊”是PMOP发病的重要因素之一,“肾虚痰生”是脂代谢紊乱和PMOP的中医病机枢纽。2.实验研究实验一:补肾化痰方可有效改善OVX大鼠的脂/骨代谢（1）对骨代谢的影响HE染色可以观察到,与假手术组比较,模型组大鼠出现骨小梁数目减少、连续性下降、排列不规则、间距增宽、脂肪含量增高等典型骨质疏松病理表现;药物干预后,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组大鼠骨组织形态较模型组明显改善。同时,与假手术组比较,模型组的BMAT相对面积明显升高（P＜0.05）;与模型组比较,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组大鼠的BMAT相对面积均明显下降（P＜0.05）。提示补肾化痰方可以有效减轻绝经后骨组织的病理改变。Micro CT检测结果显示,与假手术比较,模型组大鼠胫骨的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 均明显下降（P＜0.05）,Tb.Sp、BS/BV明显上升（P＜0.05）;与模型组比较,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组大鼠的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明显升高（P＜0.05）;Tb.Sp、BS/BV均明显下降（P＜0.05）。说明OVX大鼠出现骨量下降和骨微结构破坏,提示补肾化痰方可以有效减轻绝经后骨组织的病理改变。（2）对脂代谢的影响Micro CT检测结果显示,与假手术比较,模型组大鼠腹围、皮下脂肪体积、内脏脂肪体积明显增加（P＜0.05）。与模型组比较,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组大鼠的腹围、皮下脂肪体积、内脏脂肪体积均明显下降（P＜0.05）。各组大鼠血清指标检测可见,与假手术组比较,模型组大鼠LPN明显下降（P＜0.05）;与模型组比较,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组LPN明显升高（P＜0.05）,表明OVX大鼠脂肪分布与含量发生异常,补肾化痰方可有效改善大鼠脂代谢,同时提高血清LPN水平。实验二:补肾化痰方通过LPN-下丘脑NPY轴发挥对OVX大鼠脂/骨代谢的中枢调控作用（1）与假手术组比较,模型组大鼠LPN、OBR表达明显下降（P＜0.05）（P＜0.01）,NPY、Y2受体表达显著升高（P＜0.01）;与模型组大鼠比较,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组LPN、OBR表达明显升高（P＜0.05）（P＜0.01）,NPY、Y2水平显著降低（P＜0.05）（P＜0.01）;组间比较,补肾化痰组LPN、OBR水平较阿托伐他汀组和利维爱组低（P＜0.05）,补肾化痰组和利维爱组NPY、Y2水平较阿托伐他汀组低（P＜0.05）。说明补肾化痰方可上调下丘脑LPN和OBR的表达,进而抑制下丘脑NPY及其Y2受体的表达,从中枢途径改善OVX大鼠脂/骨代谢。（2）与模型组大鼠比较,补肾化痰组下丘脑组织NPY、Y2的下降程度较LPN、OBR的增加程度更为显著,说明补肾化痰方可能还通过其它途径抑制OVX大鼠NPY、Y2的表达而发挥中枢调节作用。实验三:补肾化痰方通过LPN激活PI3K/Akt/FoxO1信号通路调控下丘脑NPY的表达与假手术组比较,模型组大鼠下丘脑组织FoxO1表达明显升高（P＜0.05）,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1 明显下降（P＜0.05）;与模型组比较,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组FoxO1表达明显下降（P＜0.05）,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1明显上升（P＜0.05）,提示补肾化痰方可提高骨组织中PI3K/Akt/FoxO1通路各蛋白的磷酸化水平,且下调FoxO1的表达。说明补肾化痰方经LPN-下丘脑NP Y途径对O VX大鼠脂/骨代谢的中枢调控作用,是通过PI3K/Akt/FoxO1信号通路实现的。实验四:LPN介导了补肾化痰方对OVX大鼠脂/骨代谢的外周调控作用与假手术比较,模型组大鼠骨组织LPN、OBR、Runx2表达均明显下降（P＜0.05）,PPARγ表达明显上升（P＜0.05）;与模型组比较,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组大鼠骨组织的LPN、OBR、Runx2水平均明显升高（P＜0.05）,PPARγ水平明显下降（P＜0.05）,说明补肾化痰方可以促进骨组织LPN、OBR的表达,上调Runx2的表达促进成骨分化,下调PPARγ的表达而抑制成脂分化、减少BMAT的异常积累,从而维持OVX大鼠骨脂平衡,减少绝经后骨丢失。实验五:LPN经MAPKs信号系统介导补肾化痰方对OVX大鼠脂/骨代谢的外周调控作用与假手术比较,模型组大鼠骨组织的ERK1/2、p-ERK1/2、P38MAPK、p-P38MAPK表达均明显下降（P＜0.05）。与模型组比较,阿托伐他汀组、利维爱组、补肾化痰组大鼠骨组织的ERK1/2、p-ERK1/2、P38MAPK、p-P38MAPK 表达均明显升高（P＜0.05）,提示补肾化痰方上调骨组织LPN及其受体的表达,进而激活MAPKs信号系统维持OVX大鼠脂骨平衡稳态,发挥对脂/骨代谢的外周调控作用。结论1.“从痰论治PMOP”无论从中医理论还是病理生理、临床应用层面都具有合理性和可行性。2.补肾化痰方能够有效的改善OVX大鼠的脂/骨代谢,具有良好的防治PMOP的作用,作用机制与调控LPN相关。在中枢,补肾化痰方通过LPN促进PI3K/Akt/FoxO1信号通路的激活,抑制下丘脑NPY的合成和分泌,进而实现对脂/骨代谢的中枢调控;在骨组织,补肾化痰方可以上调LPN及OBR的表达,通过MAPKs信号系统,促进成骨分化、抑制成脂分化,从而维持骨脂平衡稳态,发挥对脂/骨代谢的外周调控作用。