【背景】高血压病是最常见的心血管疾病之一，压力超负荷心肌同时面临心肌重构(Ventricular Remodeling)和能量代谢重构(Metabolic Remodeling)。压力超负荷型心肌的能量代谢是处于相对负平衡状态，表现为高能磷酸键物质ATP、磷酸肌酸（PCr）减少，ADP/ATP比值升高，葡萄糖氧化占优势，而脂肪酸氧化明显减少。神经肽Y(Neuropeptide Y, NPY)是脑和心脏组织内表达最丰富的肽类物质，NPY主要通过与其受体相结合而发挥作用。在中枢神经系统， NPY是能量代谢调控和动物摄食最重要的基因之一。Y1、Y2和Y5是NPY调节动物摄食行为的关键受体，在下丘脑，负能量平衡是促进NPY释放的主要因素，并通过Y1、Y5受体促进摄食，并且优先摄取碳水化合物，Y2受体在其中的作用则正好相反。基于NPY及其受体亚型对下丘脑能量代谢调节的作用特点与压力超负荷心肌能量代谢特点的相似性，而我们的前期研究工作发现，NPY具有促心肌细胞肥大的作用，通过Y1、Y5受体刺激心肌肥大，Y2受体则抑制心肌肥大，在发生肥大的心肌中各受体表达存在差异性。NPY受体亚型在肥大心肌中表达的差异性是否受压力超负荷心肌能量代谢状态的影响，目前还未见报道。我们设想，压力超负荷致心肌能量代谢状态的变化导致NPY受体亚型差异性表达，NPY通过其受体的差异性作用，同时参与了压力超负荷时心肌的能量代谢调控和心肌重构。因此，本课题将从以下几个方面对上述问题展开研究。第一部分主要研究压力超负荷大鼠心肌能量代谢状态的变化对Y1、Y2、Y5受体表达的影响；第二部分，用原代培养的新生大鼠心肌细胞进行实验，研究体外能量负平衡对心肌细胞NPY受体亚型的影响及其机制；第三部分初步探讨Y1、Y2、Y5激动剂对心肌细胞糖摄取的调控作用。从而为心肌能量代谢和肥大的机制研究提供新的思路和线索。第一部分压力超负荷大鼠心肌能量状态变化对NPY受体亚型表达的影响1研究目的观察2天、7天、14天压力超负荷大鼠心肌能量代谢状态以及NPY受体亚型Y1、Y2、Y5表达、心肌肥大的动态变化，分析心肌能量代谢状态、NPY受体亚型和心肌肥大之间的关系。2研究方法2.1以腹主动脉部分缩窄法建立大鼠压力超负荷模型，分为：假手术组（Sham）和腹主动脉部分缩窄手术组（AAC）,再分2天、7天、14天组；采用无创尾动脉血压计检测大鼠收缩压和心率，超声心动仪测定大鼠左心室形态和功能，心脏组织学检测心肌细胞横截面积、血管周围纤维化、心肌间质纤维化；2.2采用化学发光法检测心肌组织ADP/ATP比值；2.3采用real-time PCR法检测Y1、Y2及Y5受体mRNA的表达量；2.4采用蛋白印迹法(Western-blot)检测Y1、Y2及Y5受体蛋白含量；2.5采用免疫组化法检测Y1、Y2及Y5受体在心肌中的分布和表达量。3结果3.1AAC组大鼠术后2天、7天、14天血压进行性升高，与各时间点Sham组大鼠比较，收缩压显著升高，P<0.05。各时间点AAC组大鼠心率与Sham组比较，显著升高，P<0.05。HW/BW（全心重量mg/体重g）于14天明显升高，与Sham组比较， P<0.05。LVW/BW（左心室重量mg/体重g）于7天、14天升高，与Sham组比较， P<0.05，说明LVW/BW较HW/BW更敏感。IVST的变化与LVW/BW结果一致，心肌细胞横截面积的变化与HW/BW一致，但各组心肌纤维化均不明显。说明压力超负荷模型建立成功，AAC术后2、7天心肌未发生肥大，处于压力超负荷早期阶段，14天心肌具有肥大的特征，已经进入压力超负荷代偿阶段。3.2AAC组大鼠术后2天、7天、14天ADP/ATP的比值较各时间点Sham组大鼠显著升高，P<0.05，随时间延长逐渐降低，到14天时明显下降，说明压力超负荷心肌早期耗能、耗氧较代偿期更高。3.3AAC组大鼠2天、7天、14天心肌Y1、Y2和Y5受体mRNA和蛋白的表达一致，免疫组化显示各受体亚型分布于心肌细胞胞膜、胞浆，压力超负荷早期即2天、7天，心肌组织mRNA和蛋白的表达是升高的，至14天代偿期则下降，与各时间点Sham组大鼠比较，P<0.05。4小结4.1AAC术后2天、7天心肌未发生肥大，处于压力超负荷早期阶段，14天已经发生肥大，进入压力超负荷代偿阶段。4.2AAC术后早期心肌耗能增加，处于明显的能量负平衡状态，到14天时已经出现代偿和适应性的变化。4.3AAC术后早期Y1、Y2、Y5受体的mRNA和蛋白表达升高，至14天出现心肌肥大时表达下降，与心肌ADP/ATP比值变化趋势一致。第二部分能量负平衡对心肌细胞NPY受体亚型表达的影响及其机制1研究目的观察能量负平衡对心肌细胞Y1、Y2、 Y5受体表达量的影响以及用AMPK激动剂AICAR预处理后的变化；通过检测磷酸化AMPK蛋白以及AMPK的下游调控基因ACC磷酸化水平，探讨上述生物学改变的信号调控机制。2研究方法2.1新生SD乳鼠心肌细胞培养；2.2分别以AngII10-6M, AICAR0.5M, Compound C1μM, AICAR0.5M+AngII10-6M刺激离体培养的新生大鼠心肌细胞；2.3其余检测方法同第一部分。3结果3.1ANGII、Compound C可以诱导心肌细胞ADP/ATP比值升高，给予AICAR预处理后，ADP/ATP比值下降；说明在体外ANGII、Compound C可以诱导心肌细胞能量负平衡；3.2心肌细胞在能量负平衡的状态下，Y1、Y2、 Y5受体mRNA和蛋白的表达量升高，予AICAR预处理后，随着ADP/ATP比值的下降，Y1、Y2、 Y5受体mRNA和蛋白的表达量亦下降，P<0.05。3.3正常情况下仅有部分AMPK-PThr172和ACC-PSer79表达，在AngII、AICAR的刺激下，AMPK-PThr172和ACC-PSer79活性增强，AngII、AICAR促进AMPK-PThr172和ACC-PSer79的激活。Compound C对正常心肌AMPK-PThr172和ACC-PSer79活性有轻微的抑制作用。但AngII组给予AICAR预处理后两者的作用并没有进一步加强，较AICAR组活性低，说明AICAR与AngII在激活AMPK-PThr172水平方面的作用是拮抗的。4小结4.1AngII、Compound C可以诱导心肌细胞能量代谢负平衡，AICAR可以改善这种抑制作用；4.2在心肌细胞负能量平衡下，NPY受体亚型Y1、Y2、Y5mRNA和蛋白的表达是升高的，改善细胞的能量代谢状态，他们的表达接近基础水平；4.3心肌能量代谢水平可能通过AMPK途径来调节NPY受体亚型的表达。第三部分Y1、Y2、Y5激动剂对心肌细胞葡萄糖摄取的影响1研究目的研究NPY受体Y1、Y2、Y5激动剂对心肌细胞糖摄取的影响。2研究方法2.1新生SD乳鼠心肌细胞；2.2实验分组：①Control②Y1激动剂10-7M③Y2激动剂10-6M④Y5激动剂10-6M⑤阴性对照组；2.3心肌细胞摄取2-NBDG，分别采用荧光显微镜检测荧光强度和流式细胞仪检测比较不同组别之间心肌细胞摄取2-NBDG的差异。2.4采用免疫细胞化学的方法检测GLUT4的表达和分布。3结果3.1荧光成像及流式细胞仪分析显示：与对照组比较Y1激动剂可以抑制心肌细胞糖摄取，Y2激动剂、Y5激动剂可以刺激心肌细胞糖摄取，P<0.05；3.2Y1激动剂可以抑制心肌细胞GLUT4表达或转位，而Y2、Y5激动剂可以促进心肌细胞GLUT4的表达或转位。4小结Y1激动剂通过抑制心肌细胞GLUT4的表达抑制心肌葡萄糖的摄取；Y2、Y5激动剂通过促进心肌细胞GLUT4的表达促进心肌细胞对葡萄糖的摄取。全文结论1.大鼠压力超负荷心肌早期处于能量负平衡状态，代偿性心肌肥大时能量负平衡较前改善；2.压力超负荷心肌早期Y1、Y2、Y5受体的表达升高，至代偿性心肌肥大时表达下降；3.心肌细胞能量负平衡调节了NPY受体亚型Y1、Y2、Y5的表达，可能通过AMPK途径起调节作用；4. Y1激动剂抑制心肌葡萄糖的摄取；Y2、Y5激动剂促进心肌细胞对葡萄糖的摄取，可能与他们作用心肌细胞GLUT4的表达有关。