杨树GATA基因调控光合作用及营养生长的功能研究

来源 :北京林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:mingxing020
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杨树是我国北方林业生产中的主要造林树种之一,是再生生物资源和森林碳汇的组成部分,具有重要的经济和生态价值。杨树具有较强的速生性,然而影响其快速生长的限制因子很多,例如光合作用和营养元素的吸收利用。光合作用直接影响植物生物量积累,是决定林木生产力最重要的生理过程之一。氮素是植物生长的必需营养元素,同时还影响着植物的光合效率。为了提高林业产品的产量以满足人类和社会对木材资源的需求,我们从光合作用和氮素营养利用角度研究树木速生机理,并且通过生物工程手段培育优良品种。这对提高林产品质量和数量以及对林业的发展都具有重要意义。本研究首先从生理角度比较光合作用与氮素营养对不同欧美杂交黑杨生长差异的影响。然后结合不同生长速率欧美杂交黑杨基因表达谱数据,挖掘与光合作用和氮素营养相关的重要转录因子GATA家族成员基因。并且通过基因家族生物信息学分析以及过表达和CRISPR基因编辑分析,揭示了GATA基因在植物光合作用以及氮素响应调控过程中的作用。通过研究,取得主要结果如下:(1)对三种不同欧美杂交黑杨无性系NE19([P.nigra ×(P.deltoides × P.nigra))]、DN2(P.deltoides ×P.nigra)和R270(P.deltoides × p.nigra)的生长差异比较结果表明,具有较高光合速率的无性系NE19比R270和DN2表现出更大的叶面积、更高的叶绿素含量以及株高和地径,因此表现出更快的生长速率。其次氮素营养对欧美杨无性系NE19生长影响的研究分析表明,氮素营养不足严重抑制了杨树植株的光合作用,降低了叶绿素含量、叶片数量、株高以及地径,从而导致生物量的减少。(2)本研究利用GATA结构域为信息探针,从杨树基因组中检索到39个具有GATA结构域的基因。并对这39个基因在染色体上的分布、复制、基因结构、结构域位置以及在拟南芥中的同源基因一一进行了描述。利用邻近法构建系统发育树,将39个基因分为四个亚家族(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。通过对基因启动子顺式元件分析发现,GATA的亚家族Ⅰ成员中有丰富的光信号元件,可从中推断亚家族Ⅰ中的基因参与光响应。亚家族Ⅲ成员中有许多逆境响应元件,可响应高低温和干旱等信号。并且运用实时荧光定量PCR技术分析了不同氮素处理下的NE19无性系杨树根、茎、叶组织中GATA家族成员的表达模式。结果表明即使在同一个亚家族内的GATA转录因子成员也表现出多样性的表达模式。这说明GATA家族成员在氮代谢过程中起着不同的作用。(3)结合先前的欧美杨无性系生理比较分析和基因表达谱数据结果,本研究首次从欧美杨NE19中克隆出GATA转录因子家族成员GNC(GATA Nitrate-inducible Carbon-metabolism-involved)。该基因在高生长速率和高光合速率的无性系NE19中显著上调,且在成熟叶片中高度表达。然后我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功地对杨树GNC基因进行了定点突变编辑。同时也完成了PdGNC基因过表达载体的构建,以用于后期在拟南芥和杨树中基因功能的研究,并分析比较其在草本和木本植物中的作用差异。(4)在草本模式植物拟南芥中,通过花序浸染法获得了过表达植株oxPdGNC以及突变体gnc回补植株gnc/oxPdGNC。观察生长4周的植株发现,在低氮处理下,过表达植株oxPdGNC的叶绿素含量、叶绿体数目、叶绿体面积比野生型分别高26.12%、22%、15.87%;形态上,过表达植株oxPdGNC促进了根系和叶面积的生长,分别是野生型的1.3倍、2.3倍;通过Fv/F0、Fv/Fm、qP、NPQ等叶绿素荧光参数的改变,过表达植株oxPdGNC光合速率比野生型提高了 42.17%。过表达植株oxPdGNC还通过改变基粒和类囊体数目影响了叶绿体的超显微结构,并且过表达植株oxPdGNC中具有最高的淀粉含量。总之,过表达PdGNC不仅能促进叶绿素合成、增加叶绿体数目、促进光能转化效率,以及在氮胁迫的情况下表现出对光合结构破坏的抵抗性,还能够提高氮素利用效率、促进植株生长。(5)在木本植物杨树中,通过农杆菌浸染转化叶盘法获得过表达植株oxPdGNC和CRISPR/Cas9介导的杨树GNC突变体植株crispr-GNC。对PdGNC过表达杨树的分析发现,过表达植株oxPdGNC叶绿素含量比WT提高了 25-30%,叶片面积增加了30-33%,光合速率提高了 20-28%,并且PdGNC还影响了叶绿体的超显微结构,这与该基因在过表达拟南芥中的作用相似。同时crispr-GNC植株叶片呈黄绿色,这也与拟南芥gnc突变体表型相似。区别于拟南芥中的研究发现,PdGNC还与木本植物的高生长和维管系统的发育相关。oxPdGNC植株株高分别比WT和crispr-GNC植株高~25%和~220%,而crispr-GNC植株生长显著延缓。杨树茎横切面结果发现crispr-GNC植株茎中的次生木质化过程显著增强。此外,PdGNC基因过表达促进了下游糖运输基因(PMT、STP)和电子运输过程中基因(CYP76C4、BBE14、BBE17)的表达。我们推断PdGNC基因通过影响植物体内碳的分布和分配情况来调控植物生长。总之,杨树GATA家族基因不仅影响植物的生长,而且还能响应外界环境因素。目前,尚未有关于木本植物GATA家族成员的研究,我们通过对杨树GATA转录因子家族的系统进化及表达模式的分析,克隆得到PdGNC基因并对其在拟南芥和杨树中进行基因功能的研究,揭示了PdGNC基因在木本植物和草本植物的中的相同点与不同点。这为杨树或其它木本植物的GATA家族基因生物学功能研究提供了研究基础。
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