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肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种多功能的细胞因子，参与许多重要的生理功能，但TNF-α的过表达会破坏机体的免疫平衡，与类风湿性关节炎、Crohn’s病等多种疾病密切相关。基础和临床研究都证实，抑制TNF活性是治疗这类疾病的一个有效措施。目前，已被FDA批准的TNF-α拮抗剂有TNFRII-FC融合蛋白和抗TNF-α单抗，但昂贵的生产成本或潜在的诱发人抗鼠抗体反应（HAMA）的副作用，使其广泛应用受到一定限制。开发新型TNF-α拮抗分子必要而有意义，人源小分子抗体由于其独特的治疗价值而受到人们的瞩目，但高亲和力人源抗体的获得有一定困难。本实验室在TNF-α拮抗分子研究方面取得了一定进展：自主研制的鼠抗TNF-α中和单抗Z12能特异性识别TNF-α的141～146位这一功能表位；根据理论模拟构建的TNF／抗体相互作用的复合物模型，设计获得功能性拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）；利用人抗体可变区重链框架（VH5）展示拮抗肽（PT2、PT3、PT4），设计并合成获得单域抗体（PTVH5），其活性明显好于拮抗肽，证明抗体可变区框架适于展示拮抗肽。基于此，借助已建立的“基于抗原—抗体相互作用结构信息设计新型功能分子”的技术平台，本论文提出以人抗体可变区（重链、轻链）框架展示拮抗肽（PT2、PT3、PT4、PT7）设计虚拟单链抗体构象库，借助TNF／抗体相互作用动态模式，虚拟筛选新型TNF-α单链抗体分子，合成获得单链抗体分子并通过生物学实验验证其功能。研究结果如下：1．在单域抗体PTVH5（用VH5框架来展示拮抗肽PT2、PT3、PT4）的基础上，按照“结构匹配、静电互补”的原则，从人的七类轻链可变区（VL）通用框架中选择与之匹配的Vκ1框架，用拮抗肽PT7替换Vκ1框架中的CDR3区，通过Linker连接，设计成新型分子TSA1。理论分析发现，TSA1稳定性较好，识别TNF-α的141～146功能位点（即Z12识别的位点）。生物学实验证明，TSA1能与TNF-α结合、抑制TNF-α与TNFR的结合、抑制TNF-α介导的细胞毒作用及NF-κB的激活，而且TSA1的活性比之前设计的单域抗体有显著提高(中和TNF-α介导的细胞毒实验中，单域抗体PTVH5的IC50值为56.5±3.2μmol／L；TSA1的IC50值为0.0982±0.01μmol／L)。但与S-Remicade（上市抗体Remicade的单链形式）相比，TSA1的活性较弱。2．从框架的合理选择和拮抗肽的合理定位两方面来优化设计方案，设计虚拟单链抗体构象库，以期筛选得到活性更好的拮抗分子。TSA1与TNF的动态作用模式表明，在与TNF的结合过程中，重链CDR3（HCDR3，即拮抗肽PT4）起着关键的作用。鉴于此，根据4种拮抗肽活性的差异（PT7＞PT4＞PT2≈PT3），将其中活性最好的PT7安排在HCDR3的位置，其余三个拮抗肽PT2、PT3、PT4在HCDR1、HCDR2、LCDR3的位置上随机组合。结合七类VH和七类VL框架产生的49种框架组合，利用计算机模建技术，设计人单链抗体构象库，虚拟筛选得到以Vλ1与VH5为框架设计的新型单链抗体TSA2（拮抗肽PT2、PT3、PT7分别替换HCDR1、HCDR2、HCDR3，拮抗肽PT4替换LCDR3）。理论分析表明，TSA2在与TNF-α的相互作用区域、结合自由能、分子间氢键等方面均显著优于TSA1。生物学实验证明，与TSA1相比，TSA2的活性显著提高，与理论预测结果一致。而NTSA2的活性在一定程度上与S-Remicade（上市抗体Remicade的单链形式）相接近，达到预期效果。本论文初步验证了“借助计算机模建，基于人抗体可变区的框架结构和拮抗肽，设计虚拟单链抗体构象库并从中筛选新型拮抗分子”的策略是可行的，从而为人源小分子抗体的制备提供了一条可供选择的途径。