目的:　　接触脑脊液神经核(cerebrospinal fluid-contacting nucleus，CSF-contactingnucleus)，简称触液核，是张励才等以霍乱毒素B亚单位结合辣根过氧化酶复合物(horseradish peroxidase-conjugated toxin subunit B，CB-HRP)作为示踪剂，通过侧脑室引入，在国际上首次发现并命名的脑内特殊神经核团。该神经核主要由接触脑脊液神经元(CSF-contacting neurons，CSF-CN)构成，胞体位于中脑与脑桥交界处的中脑导水管(Aqueduct，Aq)下段腹侧及第四脑室底上部的灰质中，而突起则伸入脑脊液中。既往的研究证实，触液核内的触液神经元既与脑实质的其他神经元和脑血管有形态学联系，又与脑脊液相接触。这种特殊的位置关系，使我们有理由推测，触液核可能在机体神经-神经、脑-脑脊液两个调节通路中均发挥重要作用。　　脊髓背角既是痛觉中枢传入的第一级中继站，也是脑干下行痛觉抑制系统的最终突触连接点，因此脊髓背角成为痛觉调制通路上极其关键性的作用靶点。目前已知脑干内源性下行痛觉抑制系统的主要结构包括中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray，PAG)、中缝核群(raphe nuclei，RN)、蓝斑核(locus coeruleus，LC)以及脊髓背角等。其基本调控路径是以PAG为中心，以延脑头端腹内侧区(rostral ventromedial medulla，RVM)或LC为中继站，经由脊髓背外侧束（dorsolateral funiculus，DLF）下达至脊髓背角，以脊髓背角胶质区(substantiagelatinosa，SG)，即Ⅱ板层为其最终效应部位。大量研究表明，参与下行痛觉调制的主要神经活性物质为PAG、中缝核群的阿片受体及5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，蓝斑核的去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)等，电镜研究甚至可见PAG及RN的5-羟色胺能神经纤维末梢与脊髓背角Ⅱ板层神经元有直接的突触联系。　　尽管既往的研究工作表明，触液核在疼痛调控中具有重要作用，但这种作用的具体方式、确切路径及物质基础尚不清楚。鉴于触液核在解剖位置上与脑干内源性下行痛觉抑制系统的PAG和RN互有重叠或毗邻，且在功能上参与疼痛调控有关，我们有理由推测，触液核参与痛觉调制可能通过脑干内源性下行痛觉调制系统拟或直接与脊髓背角的联系而实现。为证明上述假设，本研究将做如下探讨:1.靶向毁损触液核，观测缺失触液核对正常动物和不同疼痛模型动物痛行为的影响;2.进一步明确触液核中与痛相关物质5-HT及阿片受体的分布;3.为触液核参与下行痛觉抑制调控提供明确的形态与物质证据。　　材料与方法:　　一、靶向毁损触液核对不同疼痛模型痛行为的影响　　（一）实验动物　　成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重250-300 g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供（许可证号:苏SYXK2002-0038）。　　（二）实验分组　　免疫荧光染色分组:CB组（侧脑室注射霍乱毒素B亚单位结合辣根过氧化酶复合物[horseradish peroxidase-conjugated toxin subunit B，CB-HRP]），CB-SAP3d组（侧脑室注射霍乱毒素B亚单位结合皂草素[horseradish peroxidase-conjugatedsaporin，CB-SAP]3 days），CB-SAP5d组（侧脑室注射CB-SAP5 days），CB-SAP7d组（侧脑室注射CB-SAP7 days），CB-SAP14 d组（侧脑室注射CB-SAP14 days），CB/SAP组(侧脑室注射霍乱毒素B亚单位与皂草素混合物[horseradishperoxidase-unconjugated saporin, CB and SAP] CB和SAP)(n=3)。　　行为学检测分组:Control组(n=34)，CB-SAP组（侧脑室注射侧脑室注射霍乱毒素B亚单位结合皂草素,horseradish peroxidase-conjugated saporin，CB-SAP）(n=26)，CB/SAP组（侧脑室注射霍乱毒素B亚单位与皂草素混合物[horseradishperoxidase-unconjugated saporin，CB and SAP] CB和SAP）(n=26)，其中每组10只用于基础生理参数监测，8只用于福尔马林（Formalin）实验，Control组另外16只以及CB-SAP组和CB/SAP组另外各8只用于术后切口痛实验。　　（三）侧脑室注射靶向毁损剂、逆行示踪标记触液核　　大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪。立体定位（Bregma:1.2±0.4 mm，Depth:3.2±0.4 mm，Right to median sagittal plane:1.4±0.2 mm），侧脑室注射上述各分组药物各3μl，动物静养，灌注、固定、取材，免疫荧光染色技术标记触液核。　　（四）脊髓背角Fos蛋白表达检测　　大鼠麻醉后灌注、固定，取腰段脊髓L4-6节段，常规免疫组织化学染色技术检测脊髓背角Fos蛋白表达。　　（五）福尔马林实验　　将20×20×30 cm不透明有机玻璃盒置于玻璃板上，玻璃板高于试验台75cm，为便于观察大鼠足部活动，玻璃板下放置一面倾斜45。的镜子。实验前所有大鼠均放置于有机玻璃盒中预适应30 min，取出大鼠使用微量注射针于右足底皮下注射5％ Formalin溶液20μl，立刻放入有机玻璃盒中，观察并记录大鼠每5 min的舔足时间，连续观察记录1h。实验过程保持环境温度恒定，安静，整个实验由固定人员观察。　　（六）足底切口痛模型　　大鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，置于超净台内，碘伏消毒右后爪跖部，铺无菌洞单，参照文献介绍的方法制备切口痛模型:使用手术刀片从足底近端0.5 cm处向足趾方向纵行切开1 cm的条形切口，切开足底皮肤后，用眼科镊提起足底肌肉并纵向钝性分离，保持其起止附着点完整。切口处纱布压迫止血，使用5-0尼龙丝线行褥式缝合共2针，手术整个过程持续约5 min，术后肌注3万IU青霉素预防感染。　　（七）基础生理参数采集及痛行为检测　　大鼠智能生命体征监测仪记录呼吸频率（respiratory rate，RR）和心率(heartrate，HR);使用电子体温计测量大鼠肛温(body temperature，T);使用大鼠自发活动视频追踪系统记录分析大鼠自发活动行为(Locomotor activity)。　　（八）统计学处理　　所有计量资料均用mean±SEM表示。多组之间比较采用one-way ANOVA或two-way ANOVA(ANOVA with repeated measures)，多组之间两两比较采用Tukeypost hoc检验;所有数据均采用Graph PAD Prism5.0处理并生成统计图，α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。　　二、与痛相关物质5-HT及阿片受体在触液核的分布　　（一）实验动物　　同前。　　（二）实验分组　　免疫荧光双标染色分为3组:CB/NeuN组，CB/MOR组和CB/5-HT组(n=3)。　　（三）免疫荧光双标技术　　大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后固定至大鼠脑立体定位仪。立体定位（Bregma:1.2±0.4 mm，Depth:3.2±0.4 mm，Right to median sagittal plane:1.4±0.2 mm），侧脑室注射CB-HRP3μl，动物静养48 h后灌注、固定、取材，常规免疫荧光双标染色技术标记触液核与NeuN、MOR或5-HT。　　三、触液核参与下行痛觉抑制的形态与物质证据　　（一）实验动物　　同前。　　（二）实验分组　　实验大鼠随机分为:CB-HRP组(n=9)和CB-SAP组(n=15)，其中每组各3只大鼠用于免疫荧光染色分析，CB-HRP组6只和CB-SAP组12只用于痛行为检测。　　（三）侧脑室注射靶向毁损剂、逆行示踪标记触液核　　同前。　　（四）脊髓背角Fos蛋白表达检测　　同前。　　（五）脊髓注射逆行示踪剂　　大鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，后背部剃毛，暴露腰椎，打开L3椎板暴露L4-L5水平脊髓膨大部位，脊髓内注射逆行示踪剂RedretrobeadsTM(Ⅸ)，注射六个位点，每个位点注射0.15 ul。　　（六）触液核核团内注射　　2％异氟烷持续吸入麻醉后，参照Paxinos和Warson《大鼠脑立体坐标图谱》坐标:(Bregma:-8.2±0.2 mm，Depth:7.0±0.4 mm，Right to median sagittal plane:0.2±0.1 mm)，每只大鼠触液核注射盐酸吗啡注射液(300 ng/3ul)，停止吸入麻醉后检测痛行为。　　（七）痛行为检测　　同前。　　（八）大鼠鞘内注射　　大鼠吸入2％异氟醚短暂麻醉，后背部剃毛，拱起后背增大棘突间隙。使用带28号针头的50μl微量注射器以与脊柱呈45°向头侧刺入腰椎L2-L3间隙（相当于脊髓L4-L5膨大部位）。大鼠突然甩尾或后足抽动表明进入蛛网膜下腔。经1 min缓慢注入5-HT（80μg/20μl）后留针15s。　　（九）统计学处理　　所有计量资料均用mean±SEM表示。两组之间比较采用unpaired Studentst-test;多组之间比较采用one-way ANOVA或two-way ANOVA(ANOVA withrepeated measures)，多组之间两两比较采用Tukey post hoc检验;所有数据均采用Graph PAD Prism5.0处理并生成统计图，α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。　　实验结果:　　一、靶向毁损触液核对不同疼痛模型痛行为的影响　　（一）侧脑室引入CB-SAP靶向毁损触液核效果观察　　与CB-HRP相比，侧脑室引入CB-SAP后3-5天，中脑与脑桥交界处的Aq下段腹侧区以及第四脑室底上部的灰质中可见典型分布的CB免疫反应阳性、呈“Y”状触液核细胞群，但其细胞固缩呈三角形或菱形，伴随细胞数目的减少;侧脑室引入CB-SAP后7-14天，触液核分布区CB免疫反应阳性细胞完全消失，偶可见少量残留的CB免疫反应阳性纤维条索。侧脑室引入CB/SAP后14天，中脑与脑桥交界处的Aq下段腹侧区以及第四脑室底上部的灰质中可见典型分布的触液核细胞群。　　（二）靶向毁损触液核对大鼠基础生理参数的影响　　与Control组比较，侧脑室引入CB-SAP或CB/SAP后，大鼠基础生理指标RR、HR、T和自主活动无明显变化(P＞0.05);侧脑室引入CB-SAP后5-14天，大鼠基础痛阈PWL和MWT明显减低，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.001);而侧脑室引入CB/SAP，大鼠基础痛阈PWL和MWT无明显变化(P＞0.05)。　　（三）靶向毁损触液核对大鼠脊髓背角Fos蛋白表达的影响　　Control组大鼠脊髓背角Fos蛋白少量表达;与Control组比较，CB/SAP组大鼠脊髓背角Fos蛋白表达无明显变化(P＞0.05);而CB-SAP组大鼠脊髓背角Fos蛋白表达增加(P＜0.001)。　　（四）靶向毁损触液核对不同疼痛模型痛行为的影响　　足底注射5％ formalin后，可以观察到3组大鼠均出现典型的双相自发性痛行为反应，表现为自发性舔足或缩足:Ⅰ相（0-10 min）和Ⅱ相(15-50 min)。Control组和CB/SAP组大鼠表现出相似程度的自发性疼痛行为反应，两组比较Ⅰ相和Ⅱ相累积舔足时间无明显差异(P＞0.05)。与CB/SAP组比较，CB-SAP组大鼠自发性疼痛行为反应在Ⅰ相没有明显变化，在Ⅱ相明显增加(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，且Ⅱ相累积舔足时间明显增加(P＜0.001)。　　与Control组比较，PI组大鼠足底切口术后出现热痛觉过敏和机械痛觉异常，表现为PWL和MWT时间依赖性降低(P＜0.001);与PI组比较，CB/SAP组大鼠疼痛行为程度无明显差异(P＞0.05);与CB/SAP组比较，CB-SAP组大鼠侧脑室引入CB-SAP后12天，PWL和MWT明显减低（P＜0.001），且足底切口术后，大鼠痛行为反应程度加重，表现为PWL和MWT进一步降低(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。　　（五）靶向毁损触液核对不同疼痛模型痛行为的影响　　Formalin组大鼠脊髓背角Fos蛋白大量表达;与Formalin组比较，Formalin+CB/SAP组大鼠脊髓背角Fos蛋白表达无明显变化(P＞0.05);而Formalin+CB-SAP组大鼠脊髓背角Fos蛋白表达增加（P＜0.01）（图5 Ad）。　　Control组大鼠脊髓背角Fos蛋白少量表达;与Control组比较，PI组大鼠脊髓背角Fos蛋白表达明显增加(P＜0.05);与PI组比较，PI+CB/SAP组大鼠脊髓背角Fos蛋白表达无明显变化(P＞0.05);而PI+ CB-SAP组大鼠脊髓背角Fos蛋白表达增加(P＜0.01)。　　二、与痛相关物质5-HT及阿片受体在触液核的分布　　侧脑室引入CB-HRP后48小时，免疫荧光显示大鼠中脑导水管下段腹侧及第四脑室底上部的灰质中可见典型的红色荧光标记的CB免疫反应阳性、呈“Y”状分布触液核细胞群，其细胞呈圆形或椭圆形;绿色荧光标记的、呈NeuN、MOR或5-HT免疫反应阳性的细胞也分布于该区，且所有CB免疫反应阳性细胞与NeuN、MOR或5-HT双标。　　三、触液核参与下行痛觉抑制的形态与物质证据　　（一）触液核参与下行痛觉抑制的形态证据　　侧脑室引入CB-HRP后12天，免疫荧光染色显示，大鼠腰骶段脊髓背角浅层可见荧光标记的呈条索状或曲张体样分布的神经纤维末梢:红色荧光标记的、呈CB免疫反应阳性的神经纤维末梢，以及大量绿色荧光标记的、呈5-HT免疫反应阳性的神经纤维末梢;且所有CB免疫反应阳性纤维末梢均与5-HT双标。　　脊髓内注射逆行示踪剂Red retrobeadsTM(Ⅸ)后5天，侧脑室引入CB-FITC(直接标记触液核)，触液核分布区可见绿色荧光标记的触液核神经元细胞群，以及红色荧光逆行标记的神经元细胞群;所有红色荧光逆行标记的神经元与大部分绿色荧光标记的触液核神经元重合。　　（二）触液核参与下行痛觉抑制的物质证据　　侧脑室引入CB-SAP后12天，免疫荧光染色显示，触液核分布区无红色荧光标记的、呈CB免疫反应阳性神经元以及绿色荧光标记的、呈5-HT或MOR免疫反应阳性的神经元;仅在触液核分布区周围可见绿色荧光标记的、呈5-HT或MOR免疫反应阳性的神经元。　　侧脑室引入CB-SAP后12天，免疫荧光染色显示，大鼠腰段脊髓背角浅层绿色荧光标记的、呈5-HT免疫反应阳性的条索状或曲张体样分布的神经纤维末梢明显减少;免疫荧光光密度定量分析显示，侧脑室引入CB-SAP可使腰骶段脊髓背角浅层5-HT免疫反应阳性神经纤维密度明显减少(P＜0.01)。　　侧脑室引入CB-SAP后12天，大鼠基础痛阈PWL和MWT明显降低，触液核核团内注射吗啡(300μg/3μl)不能逆转侧脑室引入CB-SAP引起的痛阈降低;鞘内注射5-HT(80μg/20μl)可逆转侧脑室引入CB-SAP引起的痛阈降低(P＜0.001)。　　(三)5-HT或吗啡对缺失触液核大鼠脊髓背角Fos蛋白表达的影响　　CB-SAP组大鼠脊髓背角Fos蛋白大量表达;与CB-SAP组比较，CB-SAP+5-HT组大鼠脊髓背角Fos蛋白表达明显减少(P＜0.05)。CB-HRP+Morphine组大鼠脊髓背角Fos蛋白有少量表达;与CB-HRP+Morphine组比较，CB-SAP+Morphine组大鼠脊髓背角Fos蛋白表达明显增加(P＜0.05)。　　结论:　　1、侧脑室引入CB-SAP可靶向毁损大鼠触液核，此方法科学、可靠的建立触液核缺失模式动物，为研究并阐明触液核神经生物学功能提供了良好的方法学和研究工具;靶向毁损触液核可加重足底福尔马林注射后引起的自发性痛行为和足底手术切口引起的热痛觉过敏和机械痛觉超敏，本研究首次证实触液核参与痛觉抑制调控作用。　　2、本研究首次证实触液核是由一类细胞膜表达MOR的神经元构成，该神经元胞浆内含有5-HT神经递质，该研究结果提示触液核中与痛相关物质MOR和5-HT的分布介导触液核参与痛觉抑制调控作用。　　3、本研究首次发现触液核5-HT能神经元发出下行投射纤维，其末梢终止于脊髓背角，该研究结果为触液核参与下行痛觉抑制调控提供了直接的形态学依据。靶向毁损触液核后，触液核下行5-HT能神经纤维投射通路破坏;触液核核团内注射吗啡不能逆转靶向毁损触液核引起的痛阈降低，但鞘内注射5-HT可逆转靶向毁损触液核引起的痛阈降低，表明5-HT是触液核参与下行痛觉抑制调控的神经活性物质，触液核MOR可能通过调控下行5-HT能神经纤维投射通路释放5-HT递质发挥下行痛觉抑制调控作用。故本研究结果为触液核参与下行痛觉抑制调控提供明确的形态和物质证据。